研究背景食管癌(esophageal cancer,EC)是人类常见恶性肿瘤之一,由于其恶性程度高,5年生存率低于20%,已经成为世界上第八大恶性肿瘤。食管癌是我国农村发病率最高的恶性肿瘤,全球每年有约45万新增病例,中国每年确诊的食管癌患者约占全球总数的一半,并且发病率仍在逐年升高,其中90%的食管癌病理类型是食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。尽管手术及辅助放化疗等治疗技术明显进步,但是ESCC总的五年生存率仍然很低。原因在于大多数ESCC病人被发现时已经是肿瘤晚期,不适合做根治性切除术。有研究证实,早期诊断和早期治疗可获得较好的预后。而目前食管癌的早期诊断主要依靠复方碘溶液内镜下黏膜染色检查,但是其灵敏度、特异性均不理想。人们十分关心肿瘤标记物的研究和开发,希望能够寻找到灵敏度高、特异性强的肿瘤标记物。因此,寻找能够有效用于ESCC早期诊断的肿瘤生物标记物将变得非常紧迫且意义重大。近年来由于分子生物学相关技术的飞速进步,一些与恶性肿瘤病因和发病机制相关的癌基因和抑癌基因相继被发现,人们对于恶性肿瘤的认识也在不断的深化。然而基因的生物学功能并不是通过自己实现的,而是通过编码的蛋白质来执行其生物学功能的。因此,蛋白质组学相关技术的飞速发展为发现肿瘤的特异性蛋白质标记物提供新的技术平台,也为研究恶性肿瘤的病因、发病机制、治疗效果及预后奠定了技术基础。蛋白质是生命活动的实际执行者,蛋白质组学是生命科学的新亮点,它利用了临床医学、分子生物学、质谱分析(MS)和生物信息学等多种不同领域的技术工具,来共同探索和实现对蛋白质的分离、纯化和鉴定,它是研究特定组织细胞在不同时空情况下全部蛋白质表达和功能的一种高通量平台技术,能够动态、完整和定量地考察疾病发生发展过程中蛋白质种类和数量的改变,有助于寻找到疾病诊断和治疗的标记物。1997年,Unlu M结合了蛋白质组学研究中经典的双向电泳技术和特有的多重荧光分析技术,研究出一种新的定量蛋白质组学技术——双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)。将样品在双向电泳之前分别用三种不同荧光染料Cy2,Cy3和Cy5标记。这三种荧光染料带有相同的活化基团-NHS脂,可以特异性与赖氨酸残基的ε氨基结合,由于这三种染料化学结构上相似,分子量接近,带有一个正电荷,这样蛋白质与荧光染料结合后其等电点不会发生改变,保证了不同样品中的相同蛋白质可以泳动到相同的位置。将标记好的蛋白质样品混合,在同一块胶上进行双向电泳。并通过多通道激光扫描凝胶图像得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。在2D-DIGE技术中,第一次引入了内标的概念,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的,极大提高了结果的准确性,重复性和可靠性。2D-DIGE技术是目前蛋白质组学研究中可信度和准确率最高的技术之一。近年来,国内外学者对有关食管癌早期诊断的分子生物学标记物作了大量有益的研究,有些已经应用于临床实践。对食管癌患者的普查、早期诊断及预后,目前运用到的肿瘤标记物主要包括:癌胚抗原(CEA)、糖蛋白50(CA50)、糖蛋白242(CA242)、糖蛋白199(CA199)、组织多肽糖原(TPA)、细胞角质蛋白(Cyfra21-1)和神经特异性烯醇化酶(NSE)及甲胎蛋白(AFP)等,但其灵敏度和特异性仍不是非常令人满意。以往有关癌症肿瘤标记物的研究主要是利用癌症及癌旁组织,或者永生化细胞系作为研究对象。然而,血浆是机体中非常重要的组织液,血浆蛋白质组的变化能够在疾病发生早期来反映机体的健康状况,并且无痛苦无创伤,样品收集方便。从血浆中来寻找潜在的肿瘤生物标记物将能够用于肿瘤的早期诊断,因此,越来越多的研究者热衷于从外周血中来筛选蛋白标记物。研究目的筛选并鉴定能够用于食管鳞状细胞癌早期诊断用的特异性血浆肿瘤标记物,为早期诊断ESCC提供可靠的依据。材料和方法1.临床标本53例食管鳞状细胞癌患者血浆标本均来自2014年3月~2015年3月郑州大学医学院第一附属医院胸外科住院患者,且均为患者初诊时获得,未经手术及放化疗等治疗。其中ESCC组包括男性31例和女性22例,年龄50~65岁,TNM分期为Tis-T1N0M0,病理学确诊为食管鳞状细胞癌。同时,随机抽取53例正常健康组的血浆标本,这些标本均来自于2015年1月郑州大学一附院体检科健康体检者,其中包括男性26例和女性27例,年龄50~65岁。本实验经本院伦理委员会同意,且受试者均签署了知情同意书。所有的血浆标本晨起空腹抽血,室温静置1小时,3000r/min离心15min,取上清液,保存于-80℃深低温冰箱中备用。2.主要仪器和试剂SIGMA Proteo Prep Blue Albumin and Ig G Depletion Kit试剂盒、2-D Clean-up Kit试剂盒、EttanTM 2-D Quant Kit试剂盒、固相化24 cm非线性干胶条、EttanTM IPGPhor等电聚焦仪、Typhoon Imager 9400成像仪、Image Quant TL软件、De Cyder 2D差异分析软件、De Cyder V6.5分析软件、EttanTM DALT Six垂直电泳系统、ABI 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪。3.蛋白质定量应用SIGMA Proteo Prep Blue Albumin and Ig G Depletion Kit试剂盒对血浆样品进行处理,去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白,使低丰度蛋白显影增强。其他干扰血浆双向电泳的物质用2-D Clean-up Kit试剂盒去除,血浆样本中的蛋白质浓度用EttanTM 2-D Quant Kit蛋白定量试剂盒测定。4.双向荧光差异凝胶电泳制作分析胶随机抽取4例ESCC组血浆标本及4例健康对照组血浆标本各50μg,用Cy3或Cy5荧光染料进行标记反应。内标由样品蛋白各取25混合而成,用Cy2染料进行标记反应。荧光染料标记的血浆蛋白上样到固相化的非线性干胶条进行水化反应。然后应用EttanTM IPGPhor等电聚焦仪和EttanTM DALT Six垂直电泳系统分别进行第一向和第二向电泳制作分析胶。5.制作制备胶按照分析胶的制备步骤和参数,用胶体考染法进行蛋白染色,将含有同等量的各组样品蛋白混合后取800μg制作制备胶。6.筛选差异蛋白质点用波长488 nm、532 nm、633 nm的激发光分别对Cy2、Cy3及Cy5进行扫描,用Typhoon多功能扫描成像系统采集分析胶图像,可以看到Cy2、Cy3及Cy5荧光染料标记的样本图像显色分别为蓝色、绿色和红色。用De Cyder V6.5分析软件对分析胶蛋白点进行检测和匹配,配合三维图像及人工校对,筛选出感兴趣的差异蛋白点,然后在制备胶上匹配到相对应的蛋白点,最后使用EttanTM Spot picker全自动斑点切取系统对差异蛋白点进行挖取。7.差异蛋白质的分离和纯化用胰蛋白酶对挖取的差异蛋白进行胶内胶粒,将酶解后的肽段用真空冷冻干燥仪冻干,然后将冻干后的酶解肽段用Zip Tip试剂进行纯化和浓缩。8.差异蛋白质的鉴定将纯化浓缩的样品点到清洁干燥的MALDI样品靶上,点好的样品靶输入质谱分析仪中进行质谱分析。首先进行内标校正,用强度为3000-4000的激光轰击样品,获取肽质量指纹图谱,然后自动选择最强的10个母离子,用MS-MS 1KV阳离子获取及处理方式进行MS/MS二级质谱分析,从而得到肽序列标签。最后将获取的肽质量指纹图谱和肽序列标签与蛋白质序列比对的非冗余数据库(NCBInr数据库)进行比对,鉴定出高度可信的差异蛋白质。9.差异蛋白质的生物信息学分析取高度可信的蛋白结果进行下一步的生物信息学分析。首先根据蛋白质的分子功能对这些差异蛋白进行GO分类,然后利用String蛋白质相互作用预测数据库来对差异蛋白进行相互作用预测。10.Western blot验证随机选取4例ESCC组血浆标本和4例健康对照组血浆标本,进行Western-blot验证实验。11.ELISA验证随机抽取45例ESCC组血浆标本及45例健康对照组血浆标本,来进行ELISA验证实验。12.统计学方法所使用的统计分析软件为SPSS 17.0,方差齐性检验采用Levene检验,两独立样本均数比较采用t检验,取α=0.05作为差别具有统计学意义的检验标准。所有的计量资料均使用均数±标准误(x±SE)来表示。结果1.蛋白定量结果本实验先用EttanTM 2-D Quant Kit试剂盒进行蛋白定量,然后再通过蛋白染色进行验证该方法的准确性。每组随机抽取一个500μg的血浆样本上样跑SDS-PAGE电泳并且进行考马斯亮蓝染色,结果显示两组的蛋白条带灰度值基本一致,表明该定量方法准确可靠。2.分析胶的荧光图像采集经过双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)、Typhoon Imager 9400成像仪荧光扫描及Image Quant TL分析软件分析,4块分析胶均得到了清晰的蛋白质表达谱,不同染料标记的样本颜色不同,Cy2的图像为蓝色、Cy3的图像为绿色、Cy5的图像为红色。3.分析出的差异蛋白点用De Cyder V6.5分析软件进行蛋白点的检测和匹配,配合三维图像及人工校对等方法,食管鳞状细胞癌组血浆蛋白与健康对照组相比较,共筛选到了31个差异蛋白点,其中上调的蛋白点有16个,下调的蛋白点有15个。4.差异蛋白点的质谱鉴定经过胶内酶解,用MALDI-TOF/TOF质谱仪对31个差异蛋白点进行质谱分析,将获取的肽质量指纹图谱和肽序列标签与蛋白质序列比对的非冗余数据库(NCBInr数据库)进行比对,去除结果相同的蛋白质,共鉴定出12种差异蛋白质,表达上调的蛋白和表达下调的蛋白各6种。表达上调的蛋白为α1-抗胰凝乳蛋白酶、α2-HS-糖蛋白、富含亮氨酸的α2糖蛋白、锌-α2-糖蛋白、补体因子I、补体C4B;表达下调的蛋白为血清白蛋白、免疫球蛋白的α2链C区、α-1抗胰蛋白酶、纤维蛋白原γ链、触珠蛋白、血红蛋白α亚基。5.按照分子功能对差异蛋白进行GO分类按照差异蛋白的分子功能对这些差异蛋白进行GO分类,可以大概把这些蛋白质归为以下四类,分别是炎症反应、免疫反应、转运蛋白和凝血等生理功能相关的蛋白质。其中占比例最大的是炎症反应相关蛋白和免疫反应蛋白,分别为38.7%和29%,转运蛋白和凝血蛋白占的比例分别是19.4%和12.9%。6.差异蛋白质的相互作用分析利用String蛋白质相互作用预测数据库来对差异蛋白进行相互作用预测,除了IGHA2、SERPINA3和C4B外,其他9种蛋白有可能存在直接或者间接的相互作用。13.Western blot验证结果Western blot实验结果发现,AHSG和LRG在ESCC患者血浆中浓度均明显高于健康志愿者。AHSG灰度值的平均值在ESCC组升高约2.8倍左右,LRG灰度值的平均值在ESCC组升高约1.8倍左右。因此,ESCC组血浆中AHSG和LRG的WB验证结果与蛋白质组学结果是一致的。8.ELISA验证结果ELISA实验结果发现,AHSG和LRG在食管鳞状细胞癌患者(n=45)血浆中浓度均明显高于健康志愿者,与蛋白质组学结果一致。AHSG在健康对照组的浓度为140.9±27.3μg/ml(x±SE),在ESCC患者组血浆中浓度为308.4±62.3μg/ml(x±SE)。LRG在健康对照组的浓度为45.3±9.4μg/ml(x±SE),在ESCC患者组血浆中浓度为118.1±24.3μg/ml(x±SE)。Levene方差齐性检验显示两组数据方差齐性,采用两独立样本t检验,P<0.05,ESCC组和健康对照组血浆相比,AHSG和LRG的浓度均存在显著性差异。结论1.利用差异蛋白质组学平台共筛选出12种与ESCC早期诊断相关的血浆差异蛋白质,这些差异蛋白有可能成为潜在的血浆肿瘤标志物;2.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白有可能成为ESCC潜在的血浆肿瘤标记物,为ESCC的早期诊断提供新的机遇,但是仍需要扩大样本量来确定其敏感度和特异性;3.α2-HS-糖蛋白和富含亮氨酸的α2糖蛋白可能与ESCC的发病机制关系密切,尚待进一步研究;4.本实验联合应用了2D-DIGE技术,MALDI TOF/TOF质谱分析技术和生物信息学分析技术等比较蛋白质组学技术,为肿瘤标记物的筛选与鉴定提供了有效的技术支持。