朊病毒疾病是一种有代表性的蛋白质构象病,其为人所知的特点是：其致病因子,即感染型朊蛋白分子(PrPSc),能诱导正常的细胞型朊蛋白分子(PrPc)发生构象和性质的改变,成为新生的prpSc分子,并在患者或患病动物脑部形成海绵状空泡,所以又被称为传染性海绵状脑病(TSEs)。在研究朊病毒蛋白生理功能、构象转变机理和蛋白生化性质特征时,一个重要的途径是寻找PrP的相互作用蛋白,并研究其互作的机理和对PrP各方面的影响。在蛋白质相互作用研究方法中,酵母双杂交技术适于筛选cDNA文库中的互作蛋白。在本实验,我们首先使用该技术,以插入有成熟片段长度的牛PrP蛋白序列的pGBKT7-PrP质粒为诱饵质粒,从牛脑cNDA文库质粒pGBKT7-cDNA中初筛得到250余阳性克隆。通过营养缺陷筛选、颜色反应检验、自激活检验和回交测试等多途径排除假阳性后,我们确认了20个克隆为阳性克隆,对插入片段加以测序和分析,发现它们分属8个蛋白质的编码序列,其中之一是“钾离子通道四聚化结构域包含蛋白1”(KCTD1)。分析发现KCTD1的基因具有高度保守性,蛋白序列的N末端含有BTB结构域和钾离子通道四聚化结构,结合其家族成员蛋白的相关研究成果,我们认为KCTD1蛋白与PrP的相互作用有重要研究意义,故选择KCTD1蛋白和PrP的相互作用作为进一步的研究对象。接下来,我们构建了能分别表达KCTD1-GFP融合蛋白和PrP-RFP融合蛋白的真核细胞载体,将其共转染入Hela细胞后,荧光显微镜检测结果表明,两者在细胞内的分布呈共定位,这不仅进一步确证了酵母双杂交的实验结果,也验证了两者在在哺乳细胞内也存在特异的相互作用。为进一步探讨两种蛋白互作的结构基础,我们构建了一系列分别从N端和C段截短突变的"pGBKT7-PrP截短”质粒,对应于PrP蛋白各个结构域的缺失。再次利用酵母双杂交技术,以pGBKT7-KCTD1为诱饵质粒,通过营养缺陷筛选和颜色反应筛选,从上述一系列质粒中筛选与KCTD1互作的阳性质粒。其结果显示牛PrP蛋白的51-136aa片段对两者的结合是必需的,从而定位了牛PrP蛋白中与KCTD1蛋白互作的区域为：PrP 51-136。该段区域对应于人PrP蛋白的51-127aa段,包含了八肽重复区和105-126的神经毒性区。在该区域,以发现多个点突变和八肽重复区插入突变能导致人类遗传型朊病毒疾病的发生,其中又以八肽重复区的插入突变最受关注。为了验证该互作是否也存在于人源PrP蛋白和KCTD蛋白之间,同时为了探寻PrP八肽重复区在两种蛋白互作过程中的作用,我们原核表达了人野生型PrP蛋白(PrPwt)、八肽重复区3次额外插入突变型PrP蛋白(PrP8OR)以及八肽重复区缺失突变型蛋白(PrP90),并利用生物大分子相互作用仪分析得到3种蛋白与KCTD1蛋白的互作动力学特征数据。动力学分析实验在定量水平的研究这两种蛋白的互作,其结果表明：人源PrP蛋白和KCTD1蛋白之间存在相互作用,两者具有较高亲和力,这使两者的互作更具研究意义。同时该结果表明进一步确证了这一互作部位,并体现了八肽重复区在两者互作中的重要性。有三个额外插入突变的prp8OR蛋白表现出比野生型PrP蛋白对KCTD1蛋白更高的亲和力,而完全缺失八肽重复区的PrP90蛋白不与KCTD1结合。在本实验中,我们首次发现并验证了一种新的PrP互作蛋白：KCTD1蛋白。随后定位了牛PrP蛋白与其互作的区域为包含了八肽重复区和神经毒性区的PrP(51-136)段。结合动力学分析的结果表明人源PrP蛋白和KCTD1蛋白能以较高亲和力相互作用,结果同时显示八肽重复区在两者结合中起到必需而且重要的作用。这些研究结果为我们后续将要进行的两者互作功能性研究打下了良好的基础,并为提示我们后续研究可在如下几个重点力向进行：(1)KCTD1蛋白对PrP聚集行为的影响：(2)KCTD蛋白对PrP成纤维行为的影响；(3)两者互作对细胞活性或毒性的影响；(4)两吝互作与朊蛋白相关信号通路的影响；(5)对Cu2+转运和细胞抗氧化损伤的影响等。