罗非鱼(Oreochromis spp.)是世界重要养殖鱼类之一，原产地非洲，在中国也称为非洲鲫鱼、吴郭鱼等,属热带、亚热带暖水性鱼类，具有食性广、生长快、适应性强和耐低氧等优点，我国的罗非鱼养殖和出口量居于世界之首。20世纪80年代后，世界各地多种淡水和海水鱼类中相继出现无乳链球菌感染病例，发病率和死亡率呈现出逐年上升的趋势。近几年，中国南方罗非鱼主要养殖区也暴发较为严重的链球菌病，出现大规模死亡现象，不仅给养殖户带来了严重经济损失，还影响到我国出口创汇。因此如何有效控制无乳链球菌病的蔓延变得尤为迫切。基于此，本研究拟采用罗非鱼源无乳链球菌表面蛋白SIP和GAPDH作为疫苗设计靶点，开展罗非鱼无乳链球菌嵌合型疫苗的制备及免疫保护作用研究。通过PCR技术克隆出SIP、GAPDH基因后，利用重叠延伸拼接技术（SOEing）获得融合基因SIP-GAPDH，成功制备嵌合型亚单位疫苗和DNA疫苗并在体外进行了免疫保护性实验。具体研究内容及结果如下：1.将SIP，GAPDH和SIP-GAPDH基因分别克隆至原核表达载体pET-32a（+），转化大肠杆菌BL21(DE3)中，获得表达候选分子的重组工程菌（pET-32a-GAPDH、pET-32a-SIP、pET-32a-SIP-GAPDH）。这3种蛋白表达形式均以包涵体的形式存在，采用HisTrapTMHP亲和层析柱纯化得到体外表达蛋白，浓度分别为：SIP-GAPDH（670μg/mL），GAPDH（560μg/mL），SIP（520μg/mL）。2.将GAPDH、SIP、SIP-GAPDH重组蛋白分别以腹腔注射的方式免疫吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)，采用ELISA方法检测抗体效价。结果表明：3个实验组均可检测到抗体的存在，免疫组与对照组的抗体效价差异显著，且在第28d时各免疫组鱼的抗体水平达到峰值，SIP-GAPDH实验组抗体效价最高（1:8192），SIP与GAPDH组的抗体效价分别为：1:4096和1:2048。人工攻毒实验表明，该3组亚单位疫苗的免疫保护率依次为：SIP-GAPDH（90%），SIP（86.7%），GAPDH（83.3%）。Real-time PCR（qPCR）数据表明，注射亚单位疫苗以后，罗非鱼体内IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调。其中，免疫后第1d，IgM在头肾中表达量达到峰值，在免疫后第2d，IgM在脑和脾脏中的表达量迅速上调至峰值，随着时间的延长，各组织中的IgM逐渐降低到一个平稳水平，但仍高于对照组；IL-1β在脑和脾脏中的表达量在12h时即可到达峰值，头肾中的表达量在1d后到达峰值；在脑、脾脏和头肾组织中CD8的表达量均在2d后达到峰值，随后有一定下降但仍高于对照组水平。3.将成功构建的真核表达质粒pcDNA-GAPDH、 pcDNA-SIP和pcDNA-SIP-GAPDH，分别以肌肉注射的方式免疫吉富罗非鱼，采用PCR及RT-PCR方法检测以上3种重组真核质粒在各个组织（肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏）中的表达情况；分别于免疫后第7、14、21及28d采集血清，使用ELISA方法检测抗体效价；同时，免疫42d后进行攻毒实验以计算疫苗的免疫保护率。研究结果表明，实验组在免疫接种第7d和28d时，注射点周围的肌肉、脑、头肾、脾脏、鳃和肝脏中均能检测到相应的质粒。ELISA结果证明了罗非鱼血清中存在相应的重组蛋白抗体，表明DNA疫苗免疫后，各目的蛋白均诱导产生了相应抗体（免疫鱼体21d达到峰值，pcDNA-GAPDH、pcDNA-SIP和pcDNA-SIP-GAPDH的效价分别是：1:1024,1:2048,1:4096）。在第42d后对受免鱼进行人工攻毒试验，重组质粒pcDNA-GAPDH、pcDNA-SIP和pcDNA-SIP-GAPDH的免疫保护率分别为：83.3%、86.7%、93.3%。Real-time PCR（qPCR）数据表明，注射DNA疫苗以后，罗非鱼体内IgM、IL-1β和CD8基因的mRNA表达量均出现了上调。其中，免疫后第1d，IgM在脑和头肾中表达量迅速上调至峰值，在免疫后第2d，IgM在脾脏中的表达量达到峰值，随着时间的延长，各组织中的IgM逐渐降低到一个平稳水平，但仍高于对照组；在脑、头肾和脾脏组织中，IL-1β和CD8的表达量分别在12h、2d后达到峰值，随后有一定下降但仍高于对照组水平。