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质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis viruses,简称CPV)隶属于呼肠孤病毒科质型多角体病毒属。迄今为止,已在200多种昆虫体内发现有CPV的感染。病毒基因组由10-12条分段的dsRNA组成,而马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cypovirus,简称DpCPV)的基因组是由10条dsRNA组成。DpCPV主要在宿主的中肠上皮细胞中的细胞质内复制,在宿主细胞内形成多角体为其明显特征。本实验室已经完成了DpCPV基因组的全序列测定工作,本文在此基础上做了些基本的如下研究:
论文第一章介绍了呼肠孤病毒分类、基因组构成和结构,其次,对CPV做了简单的介绍研究,包括CPV简史,分类与命名,病毒粒子和其结构,病毒所含蛋白、糖类和脂类和基因组的复制和表达,最后,介绍了马尾松毛虫的危害及利用CPV进行生物防治的状况;
第二章选用pET-32a(+)高效表达外源基因的表达载体表达DpCPV nonstructureprotein5(非结构蛋白5,简称NS5),使NS5蛋白在原核中得到大量的表达通过改变诱导表达的时间,结果表明,NS5蛋白在大肠杆菌中在3h左右表达量最大。同时在优化表达条件下,使得NS5蛋白表达的蛋白具有可溶性。NS5融合蛋白具有His-Tag,用Ni+-NTA纯化表达可溶性蛋白。利用表达的蛋白免疫家兔,获得家兔血清和重组蛋白进行免疫印迹反应,鉴定了免疫蛋白的抗原性,并利用生物软件分析了表达蛋白的二级结构;
第三章介绍了DpCPV nonstructure protein1(简称NS1)蛋白在大肠杆菌中表达获得成功,该蛋白以包涵体的形式存在,SDS-PAGE分析了融合蛋白大小与计算出大小基本一致,同时利用大肠杆菌表达的蛋白作为免疫原,获得抗体。并利用酵母表达系统表达NS1蛋白,含有目的基因的pPIC9K重组质粒的酵母菌株GS115可利用甲醇诱导蛋白的表达并释放到培养液中。