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在发达国家,非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)是常见的血液恶性肿瘤之一,约占恶性肿瘤的4%；而弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)是其最常见的一种亚型,约占40%。同样,在发展中国家,DLBCL也是最常见的肿瘤之一。DLBCL是一组在细胞遗传学、免疫表型和临床特征方面均存在很大异质性的肿瘤。虽然利妥昔单抗和联合化疗能提高DLBCL患者的疗效,但仍有部分患者耐药或复发。因此,寻求新的治疗方案迫在眉睫。中药在我国用于治疗恶性肿瘤历史悠久,并且取得了一定的临床疗效。传统中药砷剂包括二硫化二砷(arsenic disulfide,As2S2)、四硫化四砷(tetra-arsenic tetra-sulfide,As4S4)和三氧化二砷(arsenic trioxide, As2O3)。1996年,上海血液病研究所首次阐明了As203可诱导急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)细胞分化和凋亡,从而引起了国内外学者对砷剂治疗血液恶性肿瘤疾病的关注。二硫化二砷是雄黄的主要成分之一,无论是在中医还是在西医的治疗均历史悠久。基础研究证实,雄黄同样可诱导ATRA敏感的细胞株NB4和ATRA耐药的细胞株MR2发生凋亡和分化。进一步研究发现雄黄诱导HL-60、NB4和K562细胞凋亡的机制是通过抑制端粒酶活性；减少BCL-2和PNAS-2的表达；并且与MAPK通路相关连。同时,雄黄诱导HL-60细胞的分化不仅与丝氨酸、苏氨酸蛋白磷酸酶1型和2A型的活性的增强,而且通过线粒体膜电位的增强来实现的。而且,砷剂诱导非霍奇金淋巴瘤细胞凋亡机制多样。在人类Burkitt淋巴瘤细胞株Raji和人类T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat中的研究中发现,三氧化二砷通过阻滞细胞周期、减少呼吸功能和线粒体膜电位,下调凋亡相关基因MCL-1进而活化caspase-3的途径来抑制增长和诱导凋亡的。进一步研究发现,Jurkat细胞和Raji细胞对砷剂诱导凋亡的敏感性存在差异,因为Jurkat细胞表达高水平的谷胱甘肽S-转移酶P1-1(glutathione S-transferase P1-1, GSTP-1)。同样,人T细胞淋巴瘤细胞株CEM研究中发现,雄黄诱导凋亡的机制是阻滞细胞停滞于G2/M期、下调Bcl-2和增加AP02.7蛋白的表达。最新研究证实三氧化二砷通过减少细胞周期蛋白D1的表达和上调凋亡相关基因的机制来抑制人滤泡淋巴瘤细胞(mantal cell lymphoma, MCL)的生长和诱导其凋亡。为了增强治疗效果并减少副作用,常采用联合化疗方案治疗肿瘤。复方黄黛片就是采用雄黄作为君药,而青黛和太子参作为臣药而组成的中药复方制剂,并且也证实其治疗APL效果显著。进一步的研究发现雄黄和青黛的有效活性成分是硫化砷(As2S2或AS4S4)和靛玉红。基础研究证实雄黄对人T细胞淋巴瘤细胞株(CEM-T)和B细胞淋巴瘤细胞株(Raji)有抑制增长和诱导凋亡作用。而且靛玉红对正正常淋巴细胞和恶性淋巴细胞,如T细胞淋巴瘤细胞株(Jurkat, CEM-T)和B细胞淋巴瘤细胞株(IM9, Reh6)均有抑制增长和诱导凋亡作用。有关AS2S2和靛玉红单药或联合对DLBCL细胞株的增殖和凋亡的影响未见提及。本研究以人DLBCL细胞株LY1和LY8作为研究对象,研究As2S2和靛玉红单药或联合对DLBCL细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨了其凋亡机制,为临床发掘新的联合治疗方案提供有力的理论支持。第一部分二硫化二砷诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡及机制探讨目的：DLBCL是NHL中最常见的一种亚型,约占40%。DLBCL是一组在细胞遗传学、免疫表型和临床特征方面均存在很大异质性的肿瘤。虽然CD20单克隆抗体利妥昔单抗和联合化疗能提高DLBCL患者的疗效,但仍有部分患者耐药或复发。因此,寻求新的治疗方案成为研究的重点。目前含砷中药的抗肿瘤特点成为研究的热点。本研究选择了人DLBCL细胞株LY1和LY8,与As2S2在体外共培养,进行细胞增殖和凋亡分析,并探讨了其凋亡机制。材料和方法：1. DLBCL细胞株LY1和LY8与As,2S2共培养2.CCK-8测定细胞增殖3.流式细胞术测定细胞凋亡4.提取RNA,进行实时定量PCR5.蛋白提取和蛋白印迹分析6.统计学分析结果：1.CCK-8结果显示：随着As2S2作用时间的延长,DLBCL细胞活性逐渐减弱；同时药物浓度越高,细胞活性越低。其差异均有统计学意义。2.流式结果显示：As2S2诱导细胞凋亡效应呈现时间和剂量依赖性,其差异均有统计学意义。3.实时荧光定量结果显示：与对照组比较,10μMAs2S2与DLBCL细胞共孵育48h,Caspase-3mRNA的表达上升,Bcl-2mRNA的表达下降,Bax mRNA的表达上升,Bax/Bcl-2的比例升高(P<0.05)。4. Western blot结果显示：与对照组比较,10μM As2S2与DLBCL细胞共孵育48h, Procaspase-3蛋白的表达下降,Bcl-2表达下降,Bax表达上升,Bax/Bcl-2的比例升高(P<0.05),并且21-KDa Bax断裂成为18-KDa Bax。结论：1.As2S2以浓度和时间依赖的方式抑制DLBCL细胞生长和诱导凋亡。2.As2S2可能是通过线粒体凋亡途径来诱导DLBCL细胞凋亡,As2S2诱导凋亡过程中伴随着Bax断裂。第二部分靛玉红增强二硫化二砷诱导弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡作用及机制探讨目的：为了增强治疗效果并减少副作用,常采用联合化疗治疗肿瘤。复方黄黛片是采用硫化砷作为君药,靛玉红作为臣药的一种中药复方制剂。靛玉红及其衍生物早期用于治疗慢性粒细胞白血病的疗效得到肯定。随着靛玉红及其衍生物抗肿瘤活性的发掘,近年来,靛玉红也成为了肿瘤研究的热点。本实验研究了靛玉红单药或联合As2S2对DLBCL细胞株LY1和LY8的作用,探讨了靛玉红对AS2S2的增强诱导凋亡的机制,有可能为临床发掘新的联合治疗方案提供有力的理论支持。材料和方法：1.靛玉红单药或联合AS2S2与DLBCL细胞株LY1和LY8共培养2.CCK-8测定细胞增殖3.流式细胞术测定细胞凋亡4.提取RNA,进行实时定量PCR5.蛋白提取和蛋白印迹分析6.统计学分析结果：1.CCK-8结果显示：靛玉红单药与DLBCL细胞共培养,随着作用时间的延长和药物浓度的增加,DLBCL细胞活性无变化。2.随着靛玉红浓度的增加,DLBCL细胞与靛玉红共培养48h,细胞凋亡率无变化。3.与As2S2组比较,靛玉红联合As2S2组DLBCL细胞活性明显下降；凋亡率明显增高,差异有统计学意义。4.实时荧光定量结果显示：与10μMAs2S2组比较,20μM靛玉红联合10μMAs2S2组caspase-3、Bcl-2和Bax的表达在mRNA水平无差异(P>0.05)。5. Western blot结果显示：与10μMAs2S2组比较,20u M靛玉红联合10μMAs2S2组procaspase-3的表达下降,Bax/BCL-2的表达升高,凋亡过程中伴随着Bax断裂。结论：1.靛玉红单药对DLBCL细胞株无抑制增殖和诱导凋亡作用2.靛玉红可增强As2S2对DLBCL细胞株的促凋亡作用,因此,As2S2是作为君药而靛玉红作为臣药发挥抗肿瘤活性的。3.靛玉红增强As2S2对DLBCL细胞株的促凋亡作用可能是通过线粒体凋亡途径；并伴随着Bax断裂。