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背景:胆汁淤积,顾名思义就是指胆汁不能正常排泄,淤积于体内而引起一系列病变综合体征的疾病,并伴有如:黄疸、皮肤瘙痒、糖代谢和脂代谢不正常等相关疾病;其发病机制复杂,病因多种多样,只要在胆汁生成或者排泄的时候任何一个环节出现问题就会导致胆汁淤积。胆石症,主要是指胆汁排泄管道或者储存胆汁的胆囊里出现了像细砂一样的东西,发病时临床多见腹痛和胆道系统感染的临床症状和体征的病症。上述两种疾病均是由胆汁排泄入十二指肠障碍引起的一类肝胆系统疾病;岭南为主要发病区,在中年人、老年人及孕妇常见这两种疾病;随着现在饮食结构改变,发病人数也不断增多,而临床用药单一,缺乏系统全面的治疗药物,因此,开发利用新药刻不容缓。广金钱草[Desmodium styracifolium(Osbeck)Merr]为豆科植物,具有清热除湿、利尿通淋的功效;常用于黄疸尿赤和尿路结石等症状疾病。现代研究表明广金钱草具有:(1)抗泌尿系统结石,(2)抗炎,(3)利胆,(4)利尿等药理作用。市场上以广金钱草作为主要原料的中成药有石淋通、消炎利胆片和消石片等。“现代缪永祺谓两广地区金钱草为广金钱草,并认为广金钱草在治疗膀胱结石,胆囊结石成效显著”。故以广金钱草为药物基础,研究其在胆石症、胆汁淤积等疾病中发挥的临床药效具有重要的现实意义。目的:基于肝脏基因及蛋白表达调节胆汁酸/胆固醇代谢及转运机制阐述广金钱草’保肝利胆’的分子作用机制及科学内涵方法:1、广金钱草的药效部位的筛选广金钱草粗粉5kg(过20目筛),分别用20倍量60%乙醇;超声提取2次,每次90min,合并2次滤液,减压浓缩至无醇味,得醇提取物,再分别用3倍量的乙酸乙酯、正丁醇各萃取5次。浓缩各部位后置于水浴锅上挥干有机溶剂,得到乙酸乙酯层浸膏,正丁醉层浸膏:用0.5%CMC-Na(称取5.0g羧甲基纤维素钠,加入超纯水定容至1L,混匀)混悬萃取物。48只雄性SD大鼠随机分为6组,分别为:①正常对照组,②模型组,③乙酸乙酯萃取物组(1.02g·kg-1),④正丁醇萃取物组(2.06g·kg-1):⑤广金钱草水煎液组(3.6g生药·kg-1),⑥阳性对照组(熊去氧胆酸UDCA、剂量 100mg ·kg-1)每组分别灌胃给药,每天一次,第五天灌胃给予a-奈异硫氰酸酯(ANIT,80mg ·kg-1)造模,第七天早晨给最后一次药,30min后,处理大鼠,观察胆汁流量;检测血清生化指标谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶AST、总胆红素TBIL、碱性磷酸酶ALP和总胆汁酸TBA的变化情况。经实验结果数据统计分析,确定广.金钱草正丁醇萃取物为有效部位。2、广金钱草正丁醇萃取物的急性毒性实验40只小鼠(雌雄各半)平均体质量18～22 g,以动物能耐受的最大浓度31.25g·ml1(相当于生药量)、最大体积(0.04mL·g-1)一日内连续灌服广金钱草正丁醇提取物2次,每次时间间隔8h,连续观察14d。3、广金钱草正丁醇萃取物不同剂量对胆汁淤积大鼠胆汁流量、基因及蛋白表达量和组织形态学变化的影响56只雄性SD大鼠随机分为7组:①正丁醇萃取物组高剂量组,②正丁醇萃取物中剂量组,③正丁醇萃取低剂量组,分别灌胃给予正丁醇萃取物;④阳性对照药组(UDCA)灌胃给予UDCA(100mg·kg-1);⑤广金钱草水煎液组灌胃给予广金钱草水提物(3.6g生药· kg-1,相当于成人临床用量的6倍);⑥正常对照组和⑦模型组分别灌胃给予等体积0.5%CMC-Na。末次给药30min,腹腔注射25%乌来糖(0.4mL·100g-1)麻醉大鼠,进行胆小管插管手术,收集胆汁,收集胆汁后腹主动脉抽取全身血,剪取肝脏、回肠和肾脏组织。计算胆汁体积,检测血清中肝功能生化指标谷丙转氨酶(ALT)、直接胆红素(DBIL)、Y-谷氨酰转肽酶(Y-GT)、一氧化氮(NO)、总胆汁酸(TBA)、环磷酸腺苷(cAMP)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、谷胱甘肽(GSH)、谷草转氨酶(AST)水平及胆汁中TBA、GSH 水平;用 RT-PCR、Western Blot 方法检测肝脏 FXRmRNA、BsepmRNA、MRP2mRNA的基因表达量及相应蛋白表达量;观察肝、回肠和肾脏组织形态学的变化。4、广金钱草正丁醇萃取部位高中低剂量抗胆固醇结石形成的作用及分子作用机制研究将105只C57BL/6小鼠随机分成7组。①正常对照组,②模型组,③熊脱氧胆酸(ursodoxycholic acid,UCDA)对照组,④广金钱草水煎液组,广金钱草正丁醇萃取物⑤高、⑥中、⑦低剂量组;每组15只,除正常对照组外,其余各组给药同时给予高胆固醇膳食(高胆固醇膳食配方为普通饲料中加入15%的脂肪、2%胆固醇和0.5%胆酸),8周后,处理所有小鼠,观察成石情况及检测小鼠血清中低密度脂蛋白胆古醇LDL-C,胆固醇TC,胆汁酸TBA,甘油三酯TG,高密度脂蛋白胆固醇HDL-C;及胆汁中胆固醇饱和指数CSI的变化;分别利用RT-PCR及化学方法检测肝X受体(Liver X receptor,LX R)、胆固醇载体蛋白(Scp2)mRNA和回肠胆固醇吸收蛋白Niemann-Pick Cl Like 1(NPC1L1)mRNA水平变化。利用Western Blot方法检测相应基因的蛋白表达量。结果:1、胆汁流量显示,正丁醇萃取物组与模型组相比各时间点胆汁流量均增加,有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。正丁醇萃取物组与模型组相比肝功能衡量指标谷丙转氨酶ALT、谷草转氨酶G0P、总胆汁酸TBA、碱性磷酸酶ALP的含量明显降低,具有统计学差异(P<0.05或P<0.01)。与模型组相比较,乙酸乙酯萃取物组的胆汁流量及生化指标改变不明显(P(?)0.05)。2、一次给予小鼠广金钱草正丁醇萃取物最大浓度和最大体积后,连续观察7天小鼠无死亡现象,饮食良好、活泼;一天内连续给药2次,连续观察14天,所有小鼠活动正常,无死亡现象。确定其最大耐受剂量相当于成人用量的1400倍;表明广金钱草正丁醇提取物毒性较小。在用药剂量范围内相对较安全。3、与模型组相比较,广金钱草正丁醇萃取物能明显增加胆汁淤积模型大鼠的胆汁分泌量,显著降低血清中ALT、AST、ALP、TBA水平而同时升高N0、cAMP、GSH水平;并能显著增加胆汁中TBA水平,降低胆汁中GSIH水平。广金钱草正丁醇萃取物能增加肝脏FXRmRNA的表达及蛋白表达,增加BsepmRNA、MRP2mRNA的基因表达量及相应蛋白表达量;与模型组相比较,广金钱草正丁醇萃取物能减少肝内胆汁淤积的程度,减少炎性细胞浸润,减轻肝细胞纤维化,降低胆小管扩增的作用。4、与结石组相比较,广金钱草水煎液及正丁醇萃取物能降低血清中TC、TG、LDL-C的含量,升高TBA、HDL-C的含量;胆囊胆汁CSI明显降低。与结石组相比较,广金钱草水煎液及正丁醇萃取物组增加(LXR)mRNA表达量、降低肝(Scp2)mRNA和回肠(NPC1L1)mRNA水平的作用,同时增加LXR蛋白表达、降低Scp2和NPCIL1蛋白表达的作用。结论:1、广金钱草经提取分离后,其中广金钱草正丁醇萃取部位具有抗胆汁淤积的作用。2、广金钱草正丁醇萃取物能通过保护肝细胞免受毒性药物损伤,促进胆汁分泌和减少胆汁及其他代谢产物在肝内的蓄积,从而达到其保肝利胆,抗胆汁淤积的作用。3、广金钱草正丁醇萃取物能通过上调肝LXR和降低肝SCP2、回肠NPCIL1的表达,促进胆固醇的转化和排泄,达到其抗固醇结石形成的作用。