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CRISPR-Cas系统是存在于细菌和古生菌基因组中的一些短的间隔重复序列,是这些原核生物在长期演化的过程中用来抵抗病毒或质粒等外源DNA入侵的一种“适应性免疫防御系统”[1]。自2012年,研究证明CRISPR-Cas系统具有非常高效地靶向基因修饰作用,并且可以应用在任何组织中,之后又证明该系统对哺乳动物基因组能进行有效地特异性修饰,说明其作为基因编辑技术有着巨大的应用前景[2]。目前大多数CRISPR-Cas的应用都源自于Streptococcus pyogenes的spCas9,另外其他原核生物中各种不同的CRISPR-Cas系统也已经被发现,并证明也可以作为有效地基因修饰工具。CRISPR-Cas9是一种RNA引导的DNA核酸内切酶,通过将入侵的噬菌体或质粒DNA片段整合到宿主染色体上的CRISPR序列中[2],转录产生成熟的CRISPRRNAs(crRNAs),其引导Cas蛋白靶向带有互补序列的外来核酸DNA,来指导同源序列的降解,从而提供免疫性。CRISPR/Cas9作为新一代的基因编辑技术,和传统的锌指核酸内切酶(ZFNs)[]和类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)[4]技术相比,使用一段特异性的RNA来引导核酸内切酶靶向切割外源DNA,而不依赖于蛋白结构域,从而完成基因编辑,操作更简洁高效。为了能够有效提高CRISPR-Cas9的热稳定性,本研究利用已经公布的热敏感突变体预测网站TSpred,对Cas9蛋白进行分析并预测潜在的可突变位点,然后利用CRISPR-Cas9介导的定点诱变方法对Cas9基因进行酶切,通过PCR的方法在Cas9基因序列中引入目的突变,并联合本实验室的“T5核酸外切酶介导的克隆方法”构建Cas9温敏突变体,最后纯化表达筛选出热稳定性高的Cas9突变体。主要内容如下:1.在NCBI中查到来源于Streptococcus pyogenes的spCas9蛋白质序列,全基因序列是由武汉金开瑞公司合成并装在pUC57克隆载体上。2.根据Cas9序列和大肠杆菌表达载体pET-23a分别设计正反向引物,然后利用PCR扩增Cas9基因,片段回收后,通过本实验室的“T5核酸外切酶介导的PCR产物定向克隆的方法”装载到pET-23a载体上。3.从蛋白质数据库查询Cas9的PDB代码,利用TSpred预测系统对Cas9蛋白进行分析获得潜在温敏突变位点。4.根据获得的可突变位点,在Cas9基因序列上寻找合适的切割位点,并设计引物来合成相应的sgRNA转录模板,利用T7体外转录试剂盒转录出需要的sgRNA,与纯化的Cas9蛋白一起对pET23a-Cas9质粒切割,回收酶切后的线性质粒当做载体备用,同时在切割位点和突变碱基处分别设计引物,利用PCR将突变引入片段中。5.通过T5克隆将突变的片段克隆到切好的载体上,转化后挑菌测序获得预想的Cas9突变体,表达纯化得到Cas9突变蛋白,检测其与原始Cas9蛋白在不同温度梯度的酶切效果,筛选出热稳定好的突变体。目前已经做了 17个位点一共70个突变体,其中筛选出来的L279E,L279F和F238G三个突变体相比野生型Cas9在50℃有着更好的切割效果,而且L279E在55℃也可以进行酶切;另外有些突变体在42℃的切割效果比野生型更差,比如位于Cas9蛋白序列的第18位的Trp,突变后酶活性降低;还有部分突变体表达量非常低,例如位于335和380 的 Leu。由于Cas9蛋白分子量非常大,单个氨基酸的突变对于整个蛋白的热稳定性影响很小,若要寻找热稳定更好的突变体,可以通过结合几个有效的单突变位点构建多点突变体。由于Cas9蛋白非常大,目前现有的的各种预测网站无法对其进行准确的多点预测,无法设计多位点突变,现在这部分工作还没有进行。