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单核细胞增生李斯特菌（listeriamonocytogenes,LM）是一种兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌，可以引起孕畜（妇）流产和脑膜炎等疾病，是对人畜具有较大危害的人兽共患病病原。该菌广泛存在于水和土壤等自然环境中，具有很强的环境适应能力，可在酸性、高盐和低温等多种复杂环境压力下生存，这也是近年来“李斯特菌病”高发的重要原因。免疫接种是预防动物传染病发生的重要手段，但是灭活苗免疫对李斯特菌病效果不佳，所以研发LM弱毒疫苗具有重要的意义。LM可穿越宿主的主要生理屏障（肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障），侵入机体后能在专职和非专职吞噬细胞（如上皮细胞、肝细胞及成纤维细胞等）中繁殖和寄生，其胞内寄生和细胞间扩散需要特定毒力因子的参与。LM不仅毒力基因众多，调节机制也非常复杂，存在着多级调控系统。现有的研究表明，LM的毒力主要受到正调节因子PrfA、应答调控因子VirR和环境应激因子SigmaB因子的调控。SigmaB操纵子可以编码RsbR,RsbS,RsbT,RsbU,RsbV,RsbW,SigmaB和RsbX共8个因子，其中SigmaB因子对PrfA、inlA、inlB和LLO等主要毒力因子具有调控作用，然而关于RsbV因子在LM毒力和环境耐受性调控方面的作用尚不清楚。鉴于此，本研究构建了LMRsbV基因缺失株，并开展了缺失株毒力、免疫原性和环境耐受性研究，探讨了LM的RsbV因子在其毒力和环境耐受性方面的调控作用，为LM弱毒疫苗的研发提供了科学依据。主要研究内容和结果如下：1、LMRsbV基因缺失株的构建与分子鉴定：利用PCR技术扩增出RsbV基因两侧的上游同源臂和下游同源臂，然后运用基因重叠PCR（SOE-PCR）技术获得RsbV基因缺失片段。将RsbV基因缺失片段插入到穿梭载体PKSV7中，构建重组穿梭质粒pKSV7-△RsbV。将pKSV7-△RsbV电转化到LM-XS5中，用检测引物对电转后的菌株和传代培养的菌株进行PCR鉴定和测序分析。结果筛选得到可以扩增出807bp和479bp两条目的片段的阳性转化子；对阳性转化子在氯霉素压力42℃条件下传代培养15代，获得具有氯霉素抗性的单交换重组株；然后再在无氯霉素压力42℃条件下传代培养15代，得到只能扩增出479bp一条目的片段无氯霉素抗性的双交换基因重组缺失株LM-△RsbV；继续在无氯霉素压力37℃条件下传达培养20代，LM-△RsbV无毒力返祖现象，说明该菌具有遗传稳定性。2、RsbV基因缺失对LM毒力和免疫原性的影响：通过人工感染小鼠后，通过LD50、肝脾载菌量、毒力基因转录水平的检测和巨噬细胞RAW264.7侵染实验分析了缺失株LM-△RsbV和野毒株LM-XS5在毒力上的差异；通过小鼠免疫攻毒实验，研究了LM-△RsbV对小鼠的免疫保护效果。结果显示LM-△RsbV的LD50为109.81CFU，LM-XS5的LD50为105.56CFU，LM-△RsbV的LD50是野毒株的104倍（P<0.01）；在不同时间点，缺失株LM-△RsbV在小鼠肝和脾内的载菌量均少于LM-XS5（P<0.05）；荧光实时定量PCR检测结果发现，缺失株LM-△RsbV4个主要毒力因子inlA、LLO、PlcA和PrfA的表达水平均显著低于野毒株（P<0.05）；RAW264.7巨噬细胞侵染实验结果显示，在3-24小时之间LM-△RsbV在巨噬细胞内的存活数量要明显低于LM-XS5（P<0.05）；LM-△RsbV对小鼠的保护率为90.0％。结果提示RsbV对LM的毒力具有重要的调控作用；LM-△RsbV缺失株仍然保持较强的免疫原性，具有作为弱毒疫苗的潜力。3、RsbV基因缺失对LM环境耐受性的影响：为了检测缺失株在环境压力耐受性方面的变化，通过人工模拟了高温、低温、高盐、酸性、表面活性剂和酒精压力等应激环境，分析了LM-△RsbV缺失株和野毒株LM-XS5在环境耐受性上的差异。实验结果表明：与野毒株LM-XS5相比，LM-△RsbV在低温、渗透压、酒精和酸性环境中的生长速度变慢，应激耐受力降低，而对表面活性剂Triton-X-100的应激耐受力没有变化，提示在低温、渗透压、酒精压力和酸性等应激过程中需要RsbV参与。