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结核病是世界上最大的传染病杀手之一,人结核病主要由结核杆菌引起,但有4.2%～10.6%的人结核由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起,是人类健康和养牛业发展的一大威胁。与结核分枝杆菌类似,肺泡巨噬细胞被认为是牛分枝杆菌感染早期的主要宿主细胞,构成机体防御的第一道防线。分枝杆菌被巨噬细胞吞噬后会激活细胞内的双链DNA识别受体,进而引起Ⅰ型干扰素的表达和自噬。IFN-β是机体产生的被认为促进结核杆菌感染的细胞因子,而宿主细胞可以通过选择性自噬降低细胞内分枝杆菌的存活,胞内双链DNA受体是否参与以及如何调节IFN-β的表达以及自噬尚不明确。本试验对IFI204和AIM2两个DNA识别受体在牛分枝杆菌感染的巨噬细胞中对IFN-β分泌和自噬的诱导中的作用进行了研究,明确了这两个识别受体的具体作用以及其作用机制,对认识分枝杆菌和宿主细胞之间的相互作用具有重要的学术价值。1.牛分枝杆菌以感染复数(MOI)为10分别感染小鼠巨噬细胞J774A.1和小鼠骨髓源巨噬细胞(BMDMs),提取细胞总蛋白检测IRF3磷酸化,分别提取胞浆胞核蛋白检测IRF3从胞浆向胞核内转移,证实了牛分枝杆菌可以引起IRF3磷酸化和IFN-β表达。牛分枝杆菌以MOI为10感染小鼠BMDMs,分别在感染不同时间检测自噬相关蛋白LC3以及p62;分别用不同MOI在感染相同时间检测自噬相关蛋白LC3以及P62表达量,结果表明牛分枝杆菌能够增强细胞自噬。透射电镜观察感染BMDMs中细菌在细胞内的位置,结果表明牛分枝杆菌感染巨噬细胞后会释放到胞浆内。2.为了研究IFI204和AIM2在牛分枝杆菌引起IFN-β表达以及自噬中的作用,本研究使用siRNA基因沉默技术分别对IFI204和AIM2的表达进行干扰,然后检测基因沉默前后牛分枝杆菌引起的STING下游相关信号分子TBK-1和IRF3的磷酸化、IFN-β分泌和自噬相关蛋白LC3表达的变化情况,以及基因沉默前后促炎因子IL-1β、TNF-α和抗炎因子IL-10mRNA水平的变化。结果表明,牛分枝杆菌诱导的IFN-β分泌和自噬依赖于IFI204及其下游STING相关信号通路,并且IFI204作用的发挥需要其乙酰化并转移至胞浆;而AIM2通过竞争性抑制STING相关下游信号通路,进而抑制牛分枝杆菌诱导的巨噬细胞IFN-β分泌和自噬。3.本研究研究了 IFI204和AIM2对感染巨噬细胞内的牛分枝杆菌存活的影响,分别使用基因沉默技术沉默小鼠巨噬细胞J774A.1和小鼠BMDMs中IFI204和AIM2的表达,检测基因沉默前后牛分枝杆菌的CFU;结果表明siRNA干扰IFI204不会影响胞内牛分枝杆菌的存活,而siRNA干扰AIM2会抑制牛分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。