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角蛋白酶是一类可特异催化降解角蛋白的酶,它具有很强的底物特异性,在很多领域例如饲料、皮革、纺织、医药等具有十分重要的应用价值,特别是在饲料加工业中,其应用前景非常广泛。但是原始菌株产酶水平往往比较低,使该酶的应用范围受到限制。因此开展高产酶水平的重组菌株的研究对农业和工业生产具有重要意义。为了获得高效表达的角蛋白酶(kerUS)基因毕赤酵母工程菌,本研究分析了来源于短短芽胞杆菌US575菌株的角蛋白酶基因kerUS的编码序列并根据毕赤酵母密码子偏爱性对该基因密码子进行优化,构建了kerUS基因毕赤酵母表达载体,并实现了在毕赤酵母中的异源表达;同时系统研究了重组角蛋白酶的酶学性质,主要结果如下。将来源于短短芽胞杆菌US575菌株的角蛋白酶基因KerUS序列去掉信号肽序列之后进行密码子优化,优化前命名为ori-KerUS,优化后命名为opt-KerUS。优化后KerUS序列(opt-KerUS)的密码子适应指数CAI值从0.69提高到0.91,GC含量由45.27%降至42.22%,并且分布均匀;其中RNA二级结构的自由能值越低越有利于蛋白表达,在GC含量波动不大的前提下修改个别碱基以去掉自由能值高的几个二级结构,以便更有效的降低总的自由能值,经修改优化其自由能值从209.8 kkal/mol降低至157.9 kkal/mol。对该优化后基因(opt-KerUS)进行序列比对分析发现,与原始基因(ori-KerUS)相比发生了205个碱基变化。将优化后的序列(opt-KerUS)经全基因合成得到该基因的DNA序列后插入pPIC9K表达载体构建重组表达质粒,电转化插入毕赤酵母GS115宿主菌株的染色体基因组中,经G418抗生素浓度梯度筛选出高效表达的pPIC9K-KerUS/GS115,在摇瓶发酵水平上,该毕赤酵母重组菌产酶酶活为340U/ml,在高密度细胞发酵水平上,该重组菌株产酶酶活高达2680U/ml,是摇瓶发酵水平的近8倍。酶学性质分析结果显示,该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为pH9.5。热稳定性研究实验表明:该酶在60℃水浴处理8h后剩余酶活力在60%以上,在80℃处理8h仍保留40%以上酶活力。pH稳定性实验表明,该酶在pH6-10缓冲液中保存12h后剩余酶活力仍有40%以上,具有较宽范围的pH稳定性。低浓度金属离子Mn2+(123%)和Ba2+(200%)对角蛋白酶活力有促进作用,此外该酶对有机溶剂有一定的耐受性,但对阴离子表面活性剂和氧化剂耐受性不强。酶学动力学常数测定,该酶Vmax=0.019g/L/min,Km=4.64g/L,酶比活力=440U/mg。