研究背景大脑和脊髓胶质细胞发生癌变,所产生的最常见的原发性脑部肿瘤即是胶质瘤,它大概占到了人类脑部肿瘤的70%-80%。脑胶质瘤包括少枝细胞瘤,混合胶质母细胞瘤,室管膜瘤和星形细胞瘤。胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM),作为一类原发性神经系统肿瘤,发病率高,恶性度极高,预后非常差,严重影响患者预后及生存质量,给家庭和社会带来沉重负担。手术目的是尽可能最大限度地去除肿瘤,又尽可能的保留神经功能。但是无法根本彻底清除微小病灶,这也是目前无法彻底治愈胶质母细胞瘤,避免复发的原因所在。患者最终死亡的根本原因多半由于胶质母细胞瘤不断地侵入和破坏周围的脑组织,致使脑功能进一步缺失,最终造成患者呼吸循环衰竭或者多脏器功能衰竭。所以,更深入地了解促进胶质母细胞瘤入侵的分子过程,进而克服胶质母细胞瘤细胞浸润周围的正常脑组织,是接下来我们面临的主要挑战。然而,尽管手术-术后放疗以及替莫唑胺联用化疗可以提高手术治疗后的生存率,但是72%的患者仍然在手术后17个月内会面临肿瘤复发,患者的五年存活率只有9.8%。鉴于胶质母细胞瘤的极差的预后,研究者开展了很多工作来努力寻找可以对胶质母细胞瘤进行分类以及预测其发生和预后的生物分子标记物。微小RNA (miRNAs)是一组(20-25个核苷酸)小的非编码RNA片段可以结合目标信使RNA,造成正常的蛋白翻译过程抑制抑或是信使RNA的失活。miRNA已被发现参与许多癌症的发生和发展过程；因此,它在诊断和治疗方面有着巨大的潜力。目前为止,1000多种miRNA被鉴定,而且在很多癌症中表达上调或者下调变化。研究者已经证实多个miRNA参与胶质母细胞瘤的形成过程,而且可能是潜在的预后靶标。2013年Hermansen和Kristensen等研究详尽的表述了合成miRNA的程序,并介绍了评估miRNA表达的方法。这些初步研究和随后的深入研究已经拓展了我们对脑胶质母细胞瘤的认识。其他研究组开展的Meta分析系统探讨了在多个研究中的miRNA差异表达：也有助于我们识别一个明确的可以改善脑胶质母细胞瘤诊断和预后的miRNA基因谱。研究者通过一些特定miRNA的生物学研究,来评估不同胶质母细胞瘤病人的组织miRNA表达差异,并由此做出预后判断。研究发现,miR-10b,在胶质母细胞瘤中的表达是上调的；而miR-7[21], miR-34a[22], miR-128 [23],miR-218 [24] miR-873 [25],与正常的脑组织相比。它们在脑胶质母细胞瘤中的表达是下调的。这些生物分子标志物,比如这两项研究发现的miRNA标签最终是否会作为一种补充或取代目前公认的肿瘤分级方法-组织病理学评估,目前还不清楚。MicroRNA-522 (miR-522)是最近研究的热门microRNA家族成员之一,已知的研究发现,它与肿瘤形成的多个生物学过程密切相关。Wang et al等带领的研究团队,发现了miR-522这种小分子,在乙肝相关的肝癌中表达显著上调,而且发现其调控肿瘤形成的原因主要是调节CCND3和CHC基因活性。Zhang eta1.等的研究团队还证实, miR-522可以促进肝脏肿瘤细胞增殖,他们发挥作用则是需要调节DKK1和SFRP2的活性。该团队亦证实了miR-522可以作为抑癌基因抑制非小细胞肺癌增殖和转移,这种作用通过上调DENND 2D基因的表达起作用。然而,miR-522参与神经胶质母细胞瘤进展的分子机制尚不清楚。本研究拟发现miR-522在脑胶质母细胞瘤细胞内的表达情况以及与脑胶质母细胞瘤增殖的相关性,并进一步探究miR-522调控胶质母细胞瘤的作用机制。美国加州大学研究者在人体内首次发现pleckstrin Homology Domain Leucine-rich Repeat Protein Phosphatases 1 (PHLPP1) 。PHLPP1被证实在细胞质和细胞核以及细胞膜上,起类似抑癌基因作用。PHLPP1在大部分组织中表达各异,可是往往在一些肿瘤组织中却是明显的低表达或者不表达,同时丝／苏氨酸蛋白激酶B(Serine/Threonine protein kinaseB, AKT,又称PKB)常常出现明显的磷酸化水平增高表现。众所周知,PI3K/AKT是一类信号通路,其在新生肿瘤的生成过程以及肿瘤转移运动中发挥重要功能。PHLPP1显示抑癌作用的生物学效应,往往通过AKT的疏水基团Ser473位点去磷酸化,导致出现负性调控。通过干涉PI3 K/AKT信号转导系统,可以起到减弱肿瘤形成的作用,从而发挥抑癌效应。已有的研究发现,PHLPP1基因属于PHLPP家族成员之一,又包括两个亚分子:PHLPP1α和PHLPP1β,它们位于18号短臂18q21.33。它的编码区全长6401bP,包括17个外显子以及四个转录区范围。其中的亚型PHLPP1α蛋白,包含1205个氨基酸,而且分子量小,仅为140 kDa。而PHLPP1β基因编码区比PHLPP1α长,有6156 bP大小。而编码它的蛋白,由1717个氨基酸组成,并且有170kDa大小的分子量。它们隶属于同一基因,可是却在两个不同的转录区内开始编码工作。PHLPP1在结构上,含有丰富的亮氨酸区域(LRR),包含一个命名的PH结构域(PH),以及梭基端的PDZ配基。它们的大小各异,其中PHLPP1β更大一些,PHLPP1α小一些,前者氨基端多了一个56 kDa的延长蛋白。PHLPP1的表达水平,在大部分肿瘤细胞中,都有所下降,起到抑癌基因作用。例如,结直肠癌细胞中,研究发现PHLPP1出现高表达,容易造成肿瘤细胞增殖严重受阻,而且促使患者的肿瘤细胞增加对关于PI3K抑制剂的敏感性;因为PHLPP1做为抑制基因,抑制肿瘤形成的整个生物学过程,因此造成：低表达PHLPP1的肿瘤细胞增殖迅速而高表达PHLPP1的细胞增殖不明显。慢性淋巴细胞白血病(CLL)这种恶性肿瘤就体现了这种特性,在其合并有13q14缺失的患者中,CLL的细胞内和组织内的两种基因表达量均明显下降或者检测不到,其中监测显示缺少PHLPPI和 PHLPP2的表达的病例大概有50%,多个系统的肿瘤,特别是恶性肿瘤如乳腺癌、女性罹患的卵巢癌、肾部恶性肿瘤如肾母细胞瘤、男性多见的前列腺癌以及肝细胞癌以及发生在腺体的胰腺癌等多种肿瘤中都出现低表达或者不表达。PHLPP1作为一种肿瘤抑制基因,在胶质母细胞瘤的发生与发展过程中,与miR-522基因有何对应关系,是本研究的主要目标。本研究主要探究miR-522在人脑胶质母细胞瘤的发生、发展中的作用和机制,并进一步探究这种调节作用是否通过肿瘤抑制基因PHLPP1起作用。本文包括两个部分内容,首先探讨miR-522在脑胶质母细胞瘤中的表达情况,以及是否促进或是抑制人脑胶质母细胞瘤的增值;其次,进一步探究miR-522对脑胶质母细胞瘤发生作用的机制如何,以及发生作用时与抑癌基因P HLPP1的对应关系。miR-522调控人脑胶质母细胞瘤细胞增殖的作用机制研究目的研究miR-522在恶性脑胶质母细胞瘤中的表达情况,并探究恶性脑胶质母细胞瘤(GBM)中miR-522异常表达的临床意义；进一步研究miR-522对GBM细胞增殖的调控作用,以及作用机制。方法将miR-522模拟物或miR-522抑制剂转染到GMB细胞中,MTT和克隆形成实验检测GBM细胞增殖能力的变化。分别用qRT-PCR和蛋白印迹法检测miR-522和PHLPP1的表达变化,Targetscan软件预测和双荧光素酶报告实验验证miR-522和PHLPP1的相互作用。结果1.miR-522在人脑胶质母细胞瘤组织和细胞中显著高表达。通过QPCR检测,我们可以明显发现,相较于正常脑组织,miR-522在脑胶质母细胞瘤组织中显著高表达；我们在脑胶质母细胞瘤细胞中进一步验证了这一结果,相对于正常脑星形细胞(NHA), miR-522也明显高表达。2.miR-522促进人脑胶质母细胞瘤细胞的增殖。使用miR-522 mimics转染脑胶质母细胞瘤细胞株U87MG。我们发现,与对照组相比,细胞转染miR-522mimics后其表达水平显著上调。而且,MTT实验,克隆形成实验和锚着非依赖性生长实验,分别证明了miR-522对脑胶质母细胞瘤细胞的生长促进作用。3.抑制miR-522的表达水平可以抑制U87MG细胞的增殖。当我们抑制miR-522的表达水平时,我们发现U87MG细胞的增殖能力减弱。我们发现,与对照组相比,细胞转染miR-522 inhibitor后其表达水平显著下调。而且,MTT实验,克隆形成实验和锚着非依赖性生长实验,分别证明了抑制miR-522的表达后,脑胶质母细胞瘤细胞U87MG的生长受到抑制。4.miR-522靶向调节PHLPP1及其他调节细胞增殖的因子。首先,我们利用生物信息学的方法(TargetScan Human 6.2),分析发现,miR-522的种子序列和抑癌基因PHLPP1的3’UTR序列互补结合。我们分别用miR-522 mimics和inhibitor转染U87MG细胞。Western blot实验表明,当U87MG外源性表达miR-522时,可以显著下调PHLPP1蛋白分子的表达情况。而且,如果人为抑制miR-522的表达水平,PHLPP1蛋白的表达反而会出现显著上调情况。接下来,我们利用报告基因实验进一步确认miR-522对PHLPP1的调控作用,我们分别构建了PHLPP1的野生型和突变型3’UTR,然后将其与miR-522 mimics或者inhibitor共转U87MG细胞。荧光素酶报告基因结果显示：miR-522过表达可以显著下调PHLPP1的野生型3’UTR的荧光素酶活性,而抑制miR-522的表达可以显著上调PHLPP1的野生型3’UTR的荧光素酶活性。但是,两者对PHLPP1的突变型3’UTR的荧光素酶活性,没有调节作用。因而我们的实验结果证明了miR-522负向调控PHLPP1的表达,这一调控作用是通过直接靶向其3’UTR的潜在结合位点实现的。同时,我们也检测了一些调控细胞增殖过程的关键分子。结果表明,当我们在U87MG细胞中过表达miR-522时,p27的蛋白表达水平和Mrna表达水平都显著下调。我们同时也发现,调节CDK并对细胞增殖其关键调节作用的分子,cyclin D1,当过表达miR-522时,其蛋白和Mrna水平显著上调；当抑制miR-522的表达时,其蛋白和Mrna水平显著下调。以上结果表明,miR-522可以调节细胞增殖调控因子,比如p27和cyclin D1,进而影响细胞增殖过程。5PHLPP1下调参与了miR-522对脑胶质母细胞瘤细胞的增殖调控作用。我们设计了特异性抑制细胞U87MG-miR-522-in来抑制miR-522的表达水平。借助siRNA,我们成功地降低了PHLPP1的表达水平。而且,克隆形成实验和锚着非依赖性生长实验,分别证明了降低PHLPP1的表达水平可以促进U87MG-miR-522-in细胞的增殖。结论因此,我们的初步研究结果表明,PHLPP1参与了miR-522对脑胶质母细胞瘤细胞的增殖调控作用,因此在未来miR-522可作为一种新的治疗GBM患者的靶标分子。