论文部分内容阅读
玉米大斑病又称条斑病、叶斑病,是世界范围内严重威胁粮食产量的一种常见叶部真菌病害。大斑病在我国东北、华北以及南方高海拔低气温的玉米和高粱种植区且气候相对潮湿条件下较易爆发,是气候流行性病害。根据寄主植物的不同,大斑凸脐蠕胞菌可分为玉米专化型（Setosphearia turcica f.sp.zeae）和高粱专化型（Setosphearia turcica f.sp.sorghi）,二者具有明显的寄主专化致病性。本文对两种专化型中效应蛋白进行筛选分析,以玉米大斑病菌中特异存在木聚糖酶基因StXYL1为切入点,利用实时荧光定量PCR技术监测玉米大斑病菌侵染进程中木聚糖酶相关基因表达情况;克隆玉米大斑病木聚糖酶基因StXYL1,对其编码蛋白进行生物信息学分析;原核诱导表达StXYL1蛋白,对其进行蛋白纯化及相关酶学性质分析。具体研究结果如下:1.通过对凸脐蠕孢菌玉米、高粱专化型中分泌蛋白和效应蛋白编码基因预测分析结果显示,玉米专化型和高粱专化型中分别存在521和704个分泌蛋白,其中分别包括137和160个效应蛋白。8个和6个功能注释基因分别存在于玉米专化型和高粱专化型效应蛋白编码基因中。对玉米大斑病菌中5个木聚糖酶相关基因表达量分析结果显示,除StXYL4出现负调控外,StXYL1、StXYL2、StXYL3以及StXYL5在病程发展过程中虽均表现出正调控作用,且不同基因在不同时间点表达水平存在差异。StXYL1基因的表达水平最高,其在玉米大斑病菌侵染植株过程中起到重要作用。2.成功克隆出玉米大斑病菌木聚糖酶基因StXYL1,基因序列分析结果显示,该基因全长为998 bp,其中开放阅读框为897 bp,包含两个内含子,分别位于序列的210-255bp处和519-573处。通过生物信息学软件对StXYL1蛋白进行分析,结果显示,该蛋白由298个氨基酸组成,分子质量约为32.74 k Da,理论等电点p I为7.74,分子式为C1448H2253N403O445S10,原子总数为4559,不稳定指数为34.49,脂肪指数为75.60,具有较稳定的蛋白结构,为亲水性蛋白,不具有跨膜结构域,具有信号肽,为分泌蛋白,存在糖苷水解酶10家族蛋白（GH10）结构域;二级结构存在4种类型,其中随机线圈卷曲结构含量最高,β-转角含量最低,二级结构的模型相对简单;三维结构模型序列占总蛋白序列的93%,且存在α-螺旋、β-折叠以及一些不稳定结构;系统进化树分析显示,StXYL1蛋白与玉米大斑病菌Et28A糖苷水解酶10家族蛋白成员同源性最高,一致性达到100%,而与其他病原真菌同源关系均存在较大差异。3.成功构建出原核表达载体p GS21-T-StXYL1C-GST,将其转入大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达,获得一个分子量约为59KD的重组蛋白（GST蛋白为26KD,StXYL1蛋白为33KD）,表明StXYL1重组蛋白诱导成功。IPTG诱导浓度与诱导时间优化结果显示,该重组蛋白IPTG诱导的最适浓度为0.1mmol/L,最佳时间为2h。对纯化、透析后的蛋白进行检测,其浓度为0.5mg/m L,总量为2mg,满足试验需求。酶学性质分析结果表明,重组蛋白酶活性的最适反应温度为45℃,最适反应p H为6.0,最佳反应时间为30min。