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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种以妊娠母猪繁殖障碍、仔猪的高死亡率和严重呼吸系统症状为特征的病毒性传染病。该病自20世纪80年代末期在美国首次出现以来,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。预防控制PRRS的主要措施是接种疫苗,但当前使用的灭活疫苗和弱毒疫苗存在免疫效果差或散毒的风险等问题,所以亟需研制安全有效的PRRS新型疫苗。GP5蛋白作为PRRSV最主要的保护性抗原,在机体清除PRRSV过程中发挥着重要的作用。M蛋白是PRRSV最主要的囊膜蛋白,在PRRSV中M蛋白通过二硫键与GP5蛋白形成异源二聚体,这种异源二聚体的形成可以促进GP5蛋白所诱导的中和抗体的产生,同时M蛋白也具有诱导中和抗体的能力。GP3是一种高度糖基化的PRRSV包膜蛋白,已证实GP3蛋白中存在中和表位,可以诱导中和抗体的产生。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白是TLR5的配体,也是T细胞依赖性抗原,能诱导产生Th1/Th2混合型免疫反应,是一种具有良好应用前景的疫苗佐剂。为了获得理想的PRRSV候选疫苗,本研究构建了共表达PRRSV GP5、M和GP3蛋白的重组真核表达质粒,并以纯化的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白为佐剂,在小鼠模型上对其免疫效果进行了评价。具体研究内容如下：1.抗PRRSV GP3蛋白单克隆抗体的制备将原核表达的PRRSV GP3蛋白作为免疫原,免疫6周龄Balb/C雌性小鼠,经过ELISA检测后取血清抗体效价达1：10000以上的小鼠的脾脏,制备脾细胞后同SP2/0细胞进行融合。经过3次间接ELISA检测筛选和有限稀释法克隆后,获得16株稳定分泌抗GP3抗体的杂交瘤细胞株,并经、Vestern Blotting和IFA检测证实其中10株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能与真核表达的GP3蛋白发生特异性反应。2.共表达GP5、M和GP3蛋白重组真核质粒的构建利用特异性引物通过PCR分别扩增人工合成的修饰型ORF5(synORF5)和修饰型ORF6(synORF6)及ORF3、CMV启动子和SV40pA,并进一步通过重叠延伸PCR技术将目的基因连接起来,获得synORF5-SV40pA、CMV-synORF6-SV40pA和CMV-ORF3-SV40pA,将这3个片段依次克隆到真核表达载体pVAX1中,获得共表达PRRSV GP5、M和GP3蛋白的重组真核表达质粒pVAX-ORF3/5/6。将pVAX-ORF3/5/6转染细胞,经过Western Blotting证实GP5和GP3蛋白获得表达。3.鞭毛蛋白的表达与纯化以鼠伤寒沙门氏菌为模板,PCR扩增鞭毛蛋白基因并克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组原核表达质粒pET-32a-Flic,将构建的原核表达质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测证实鞭毛蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,并主要以不溶性包涵体的形式存在。提取包涵体经复性后获得纯化的鞭毛蛋白。4.以鞭毛蛋白为佐剂的核酸疫苗免疫小鼠后诱导的免疫反应将鞭毛蛋白以不同的免疫剂量(100μg/只、50μg/只和10μg/只)与核酸疫苗(100μg/只)混合后肌肉注射免疫Balb/C小鼠,同时以不加佐剂的核酸疫苗和空白载体pVAX1免疫小鼠作对照,利用ELISA检测小鼠首免后第3周和6周血清中的ELISA抗体,并通过中和试验检测小鼠首免后6周血清中的中和抗体,结果各免疫组小鼠均诱导产生了一定水平的针对GP5、M和GP3的ELISA抗体和中和抗体,但以加有100μg鞭毛蛋白佐剂的免疫组所诱导的ELISA抗体和中和抗体水平最高,表明鞭毛蛋白作为佐剂能增强核酸疫苗诱导的体液免疫反应。于首免后6周取小鼠脾脏制备脾淋巴细胞,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法分别检测小鼠脾淋巴细胞IFN-γ在mRNA和蛋白水平的表达,结果各免疫组均能诱导较高水平的IFN-y的表达(P<0.05),并以加有鞭毛蛋白佐剂的免疫组所诱导分泌的IFN-γ(分别为1034.94pg/mL、893.01pg/mL和793.01pg/mL)显著高于未加鞭毛蛋白佐剂的免疫组(465.95pg/mL)(P<0.05),表明鞭毛蛋白能显著增强核酸疫苗诱导的细胞免疫反应。