第一部分声带任克氏水肿和声带癌患者的吸烟水平及艾森克人格问卷调查与分析研究目的：吸烟可导致声带发生氧化应激损伤,表现为较强的炎性反应,氧化应激损伤与声带恶性病变有密切的关系。另一方面,吸烟也是声带良性病变任克氏水肿的重要病因,然而,吸烟诱导其发病且几乎不转化为癌的分子机制目前尚不清楚。除了吸烟这一致病因素,任克氏水肿患者通常还存在用声过度史,此因素与声带恶性病变无明显相关性。既往研究发现在其他组织细胞中,一定程度的机械性拉伸力能够抑制不良刺激诱发的炎症反应,促进细胞外基质合成,有利于组织细胞的损伤修复。因此我们假设声带在发声振动过程中所产生的作用于声带成纤维细胞的拉伸力能够抑制吸烟诱导的炎性反应,缓解声带的炎性损伤,最终可能延缓或抑制声带任克氏水肿向恶性病变的转化。本研究旨在通过临床调查评估任克氏水肿与声带癌患者的吸烟水平,同时运用艾森克人格问卷(Eysenck Personality Questionnaire, EPQ)的内-外向(Intraversion-Extraversion,简称E)维度值评估研究对象的内-外向型性格,客观的证实两组患者用声量的差异,为进一步探讨吸烟和发声振动对声带的影响提供理论基础。研究方法：以2009年9月-2011年12月期间就诊并行手术治疗的67例任克氏水肿,55例声带鳞状细胞癌以及60例健康对照为研究对象。任克氏水肿及声带癌患者均为长期吸烟者,运用吸烟持续时间及每天吸烟支数评估总吸烟水平,即采用每天吸烟支数乘以吸烟年数所得总吸烟量(pack-years, PKY)比较分析各组研究对象的吸烟水平；运用艾森克人格量问卷调查量表中的E维度分别评估任克氏水肿患者,声带癌患者以及健康对照组的内-外向型人格,E维度得分高表示具有健谈善于交往的人格特点,客观反映用声量多,然后对所得数值进行相关统计学分析,从而能够客观反映各组研究对象用声量的差异。研究结果：吸烟水平调查：任克氏水肿患者和声带鳞状细胞癌患者的总吸烟量PKY分别为45.69±11.15和46.38±10.50,二者均为中／重度吸烟者,两组间比较差异无统计学意义(t=0.35,P=0.7257)。EPQ调查分析：任克氏水肿患者、声带鳞状细胞癌患者及正常对照组的E维度值分别为62.61±7.02,41.35±7.01和49.2±5.55。三组E维度值有显著性差异(F=165.02,P<0.0001)；任克氏水肿患者的E维度值显著高于正常对照组及声带癌患者的E维度值,声带癌患者的E维度值显著低于任克氏水肿及正常对照组,三组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)；三组研究对象的内-外向型性格组成比分析有显著性差异(χ2=158.7225,P<0.0001),任克氏水肿患者多倾向于外向型性格,声带癌患者多倾向于内向型性格,即任克氏水肿患者用声量显著高于声带癌患者(χ2=158.7225,P<0.001)。研究结论：声带任克氏水肿患者与声带鳞状细胞癌患者的总吸烟量无显著差异；EPQ调查结果显示声带任克氏水肿患者多为外向型性格,表现为健谈及善于交流,而声带癌患者倾向于内向型性格,客观反映出任克氏水肿患者的用声量显著高于声带癌患者。此研究结果提示在相同的吸烟刺激下,声带发声振动水平的差异可能为导致不同的病变性质的原因,吸烟刺激与发声振动共同参与任克氏水肿的发病发展,可能为延缓或阻止任克氏水肿向恶性病变进展的原因。第二部分任克氏水肿组织和声带癌癌旁组织的任克间隙中CD44, COX-2及MMP-9的表达及意义研究目的：吸烟导致呼吸道组织细胞的共同病变特点是慢性炎症,任克氏水肿是在慢性炎症刺激下形成的声带良性病变,并且几乎不转化为癌。既往有研究证实声带任克氏水肿组织中抗氧化应激作用的相关因子表达升高,提示任克氏水肿组织可能具有化学抗癌的作用,但导致其抗氧化应激能力增强的机制尚不明确。声带任克间隙内的代谢对维持声带的正常结构及功能有重要作用,作为透明质酸酶的受体,CD44与之结合后能够抑制任克间隙成纤维细胞促炎因子COX-2和MMP-9的表达。癌旁组织中肿瘤相关成纤维细胞释放的炎性因子COX-2和MMP-9参与肿瘤的发生发展及预后。该研究旨在通过比较CD44, COX-2及MMP-9在声带任克氏水肿和声带癌旁组织中的表达差异,探讨在相同的吸烟刺激和不同程度的发声振动作用下,声带任克氏水肿组织和声带癌旁组织中CD44, COX-2及MMP-9的表达差异及意义。研究方法：任克氏水肿组织、声带鳞状细胞癌的癌旁组织及正常声带组织各20例,癌旁组织及任克氏水肿组织取自2009年9月-2011年12月期间就诊并显微外科手术切除标本,正常声带组织取自下咽及食道癌未侵犯喉需做全喉切除的患者,该组患者无吸烟及用声过度史。显微镜下分别分离并获取各组的任克间隙组织作为研究对象。运用逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)及蛋白印迹(Western blot, WB)检测并比较任克氏水肿、声带癌旁组织及正常声带组织任克间隙内CD44, COX-2及MMP-9的基因及蛋白表达水平。研究结果：设对照组的CD44, COX-2及MMP-9基因及蛋白表达均为100%,RT-PCR及WB结果显示任克氏水肿组织中CD44基因及蛋白表达水平较声带癌癌旁组织内的表达显著升高,促炎因子COX-2及MMP-9在声带任克氏水肿组织中的表达较声带癌癌旁组织内的表达显著降低(P<0.05)。研究结论：在无显著差异的总吸烟量诱导下,任克氏水肿的任克间隙内CD44的基因及蛋白水平较声带癌癌旁组织显著增高,然而,促炎因子COX-2及MMP-9的水平显著降低,说明任克氏水肿组织内炎性因子的释放较声带癌癌旁组织内炎性因子的释放明显减少。由于COX-2和MMP-9在炎性组织及癌旁组织的生物学活性对肿瘤的发生,复发及进展有重要作用,本研究结果提示在吸烟刺激下的任克氏水肿组织较声带癌旁组织具有较强的抗炎作用,可能在一定程度缓解或阻止吸烟诱导的恶性转化。第三部分周期性拉伸力抑制吸烟诱导的声带成纤维细胞炎性因子的释放研究目的：声带任克氏水肿和声带鳞状细胞癌患者的总吸烟量无显著差异,吸烟能够导致声带的炎性损伤,通过上述研究,我们发现任克氏水肿的任克间隙内CD44的基因及蛋白水平较声带癌旁组织显著增高,促炎因子COX-2及MMP-9的水平显著降低,本结果提示任克氏水肿组织内存在抗炎机制,从而能够抑制吸烟诱导的炎性因子的释放。上述研究还证实声带任克氏水肿和声带鳞状细胞癌患者的用声数量有显著差异,在声带的发声振动过程中,对任克间隙内的主要功能细胞声带成纤维细胞可产生一定模式的拉伸力,既往研究发现机械性拉伸力能够抑制成纤维细胞炎性因子释放,促进组织的损伤修复。因此,我们设想用声程度的差异导致组织细胞对吸烟刺激的反应不同,声带振动过程中作用于声带成纤维细胞的周期性拉伸力对吸烟诱导的炎性反应具有抑制作用,任克氏水肿是吸烟诱导炎性损伤和声带振动诱导的抑制炎性因子释放共同作用的结果。本研究旨在探讨周期性拉伸力(cyclic tensile strain, CTS)和香烟烟雾冷凝液(cigarette smoke condensate, CSC)对声带成纤维细胞CD44, COX-2及MMP-9基因及蛋白表达的影响。研究方法：运用原代培养技术培养人正常声带任克间隙内的成纤维细胞正常声带组织取自下咽及食道癌未侵犯喉并需做全喉切除患者,该组患者无吸烟及用声过度史。显微镜下切除分离得到任克间隙组织,运用组织法进行原代细胞培养,并采用免疫荧光技术进行形态观察与鉴定。分别用CSC或/和CTS对人声带成纤维细胞进行干预刺激,采用MTT测定法确定细胞的相对存活率,根据MTT结果确定实验所用CSC的浓度以及CTS的强度。将原代培养的人声带成纤维细胞分为四组,分别为正常对照组,单纯CTS作用组,单纯CSC作用组,CTS和CSC共同作用组。分别作用24小时后采用RT-PCR及WB检测并比较不同的作用组内人成纤维细胞的CD44, COX-2及MMP-9的基因及蛋白水平。研究结果：原代培养3-6天后,可观察到细胞自组织碎片边缘迁移生长。迁移出的细胞呈纺锤形,免疫荧光技术鉴定结果显示,第4-6代原代培养细胞均为人声带成纤维细胞；CSC造成人声带成纤维细胞炎性损伤及死亡,且随着剂量的升高CSC对细胞的致死率升高；MTT测定法确定实验采用的CSC的浓度为400μg/mLCTS的频率及强度为0.5Hz,8%,作用时间为24h; CTS(8%,0.5Hz,24h)能够抑制CSC(400μg/mL,24h)诱导的细胞死亡,提高存活率；设对照组CD44, COX-2及MMP-9基因及蛋白表达均为100%,RT-PCR及WB检测结果示CSC和CTS共同作用组中CD44的基因及蛋白表达较CSC单独作用组显著升高(P<0.05)；COX-2及MMP-9的基因及蛋白在CSC和CTS共同作用组的表达显著低于在CSC单独作用组中的表达(P<0.05), CTS能够抑制CSC诱导的炎性因子的释放。研究结论：该研究证实作用于人声带成纤维细胞的CTS能够通过CD44显著抑制CSC诱导的炎性因子COX-2及MMP-9的释放,从而使细胞受到的炎性损伤降低。任克氏水肿是吸烟诱导的炎性损伤和声带振动诱导的抗炎反应共同作用的结果,声带的发声振动抑制了由吸烟诱导的炎性反应,最终促进组织细胞的修复,这一作用机制可能是任克氏水肿未逐步转化为癌的原因。同时本研究结果提示一定模式的发声训练能够促进声带组织的损伤修复,能够为吸烟所致声带炎性损伤的治疗提供新的思路。