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[研究目的]结直肠癌的新发病例数和死亡例数在所有恶性肿瘤中均占第三位,我国结直肠癌的发病率和年龄标准化死亡率一直呈上升趋势。手术切除是结直肠癌目前最主要的治疗手段,联合5-氟尿嘧啶为基础的化疗是进展期结直肠癌患者的标准治疗方案,贝伐单抗、西妥昔单抗等靶向药物的应用减少了术后复发,使结直肠癌患者的生存率有了明显改善,也可以使部分转移病人获益。然而,具有KRAS突变(占40-45%)或BRAF突变(占KRAS野生型的8-15%)的患者无法从现有的靶向治疗获益,且许多早期有治疗效果的患者最终因肿瘤的获得性耐药而治疗失败,许多患者在诊断后5年内复发转移,因此,近年来许多研究者将目光投向肿瘤微环境去寻找新的靶点。在本项研究中,我们的目的是明确结直肠癌间质中骨膜蛋白(POSTN)的表达形式及其与患者预后的关系,证实POSTN高表达成纤维细胞对结直肠癌细胞恶性表型的影响,并进一步探究其作用机制。[研究方法]回顾性分析于2001年1月至2009年12月期间在上海长海医院以及于2000年1月至2006年1月期间在广州中山大学第六附属医院接受根治性手术的共1098例结直肠癌患者的临床病例资料并收集其术后石蜡组织标本,应用免疫组化法检测结直肠癌石蜡组织标本中POSTN的表达分布以及表达水平,根据免疫组化评分定义POSTN表达水平高低,统计分析POSTN在上皮细胞和间质细胞以及癌旁组织、原发组织和转移组织中的表达情况,结合长期随访数据进行生存分析评估POSTN表达水平与结直肠癌患者预后的关系,并使用多因素Cox比例风险回归模型来评估年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期、肿瘤分化程度、清扫淋巴结数、血清CEA、CA19-9以及间质POSTN表达和上皮POSTN表达对患者生存期的影响,评价肿瘤间质中POSTN表达与癌上皮细胞中POSTN表达对结直肠癌预后的判定能力。细胞水平应用慢病毒载体构建过表达POSTN的成纤维细胞,通过细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞迁移实验评估POSTN对成纤维细胞生长、迁移的影响,采用表达谱芯片技术分析POSTN表达水平改变对成纤维细胞中基因表达的影响;将过表达POSTN的成纤维细胞与大肠癌细胞间接共培养,从细胞增殖、克隆形成、侵袭、耐药等方面检测过表达POSTN的成纤维细胞对大肠癌细胞恶性表型的影响。机制研究方面,采用人重组POSTN蛋白(rhPOSTN)和PI3K/Akt激酶抑制剂、β-catenin抑制剂处理大肠癌细胞,检测大肠癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、耐药能力的改变,从而评估POSTN对癌细胞的作用是否经由PI3K/Akt或者β-catenin信号通路介导。采用生物信息学分析的方法评价结直肠癌中POSTN与其他癌相关成纤维细胞标志性分子之间的关系。[结果]石蜡标本免疫组化染色显示POSTN主要位于结直肠癌上皮细胞和肿瘤间质细胞的胞质中,其在间质细胞中的分布比在癌上皮细胞中更加密集,并且间质POSTN在转移癌组织中的表达水平显著高于在原发肿瘤组织中的表达水平(P<0.001 ),其在原发肿瘤组织中的表达水平也显著高于在癌旁组织中的表达水平(P<0.001)。Kaplan-Meier生存分析以及log-rank分析显示,肿瘤间质高、中、低表达POSTN的三组患者之间的无病生存期(DFS)和疾病特异性生存期(DSS)差异均十分显著(P<0.001),间质POSTN高表达预示结直肠癌患者预后不良,同时间质POSTN还能提示III期接受化疗的结直肠癌患者的预后情况;癌上皮细胞中POSTN的表达水平也与结直肠癌进展和预后相关,但是其对预后的判定能力与间质POSTN相比较差。多因素Cox比例风险回归模型分析显示,POSTN在肿瘤间质中而非在癌上皮中的表达水平分级是结直肠癌患者无病生存期(DFS)和疾病特异性生存期(DSS)的独立风险因素。大肠癌细胞与过表达POSTN的成纤维细胞共培养后,其增殖能力、克隆形成能力、侵袭力和耐药力明显增强;使用rhPOSTN处理大肠癌细胞也能够增强细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭力和耐药力,而PI3K/Akt激酶抑制剂和β-catenin抑制剂则能够削弱rhPOSTN对大肠癌细胞的这种促进作用。大肠癌细胞RKO能够诱导成纤维细胞表达POSTN,过表达POSTN的成纤维细胞增殖能力、克隆形成能力和迁移力明显增强,而PI3K/Akt激酶抑制剂和β-catenin抑制剂能削弱POSTN对成纤维细胞的影响;基因表达谱芯片分析显示,POSTN表达升高后成纤维细胞中多种细胞因子、细胞粘附分子以及骨形态发生蛋白BMP-2的表达上调,GO富集分析提示POSTN表达升高可引起跨膜转运、受体结合、信号传导、细胞因子/化学因子活动、细胞外基质、细胞膜等分子功能、生物学进程和细胞组成的改变。生物信息学分析显示,POSTN的转录水平与多种癌相关成纤维细胞标志物显著相关(皮尔松相关系数>0.70,P <0.01)。[结论]肿瘤间质中POSTN高表达提示结直肠癌患者不良预后。癌细胞与间质细胞之间以旁分泌的方式相互作用,大肠癌细胞可诱导正常成纤维细胞表达POSTN;高表达POSTN的成纤维细胞具有癌相关成纤维细胞的特性和功能,能够通过激活PI3K/Akt和(或)Wnt/β-catenin通路而促进结直肠癌细胞的恶性表型;同时间质POSTN以旁分泌或自分泌模式通过激活PI3K/Akt或Wnt/β-catenin通路而促进自体成纤维细胞的增殖、迁移和克隆形成能力。