前言 基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)是分解细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的蛋白酶类中最重要的一类。近年来，有人发现脑缺血及再灌后出现MMPs增加，尤其是MMP-9和MMP-2活性增加与脑微血管通透性、血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)通透性、BBB崩溃、炎细胞侵入和脑水肿明显相关。使用合成的MMPs抑制剂可以不同程度抑制以上改变。 本实验的目的在于研究短暂的MCAO诱导局灶脑缺血后MMP-2及MMP-9在不同时相的表达及细胞分布情况，进一步评估MMP-2及MMP-9与缺血脑组织损伤的关系。 材料和方法 一、动物来源及分组 健康雄性Wistar大鼠40只，体重250-280g。 随机分组(1)对照组1正常对照组n=5；2假手术组n=5；(2)实验组1-6组，动物缺血90分钟再灌注6小时为1组；再灌注12小时为2组；再灌注24小时为3组；再灌注2天为4组；再灌注5天为5组；再灌注7天为6组；每组n=5。 二、大鼠短暂脑缺血动物模型建立 腹腔注射10％水合氯醛按35mg/100g的制剂注射麻醉。置大鼠仰卧位固定于手术台上，颈正中切开，手术显微镜下分离右侧总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)颈内动脉(ICA)，热凝并切断ECA两分支枕动脉，甲状腺上动脉，结扎并游离ECA主干一段，沿ICA分离ICA的颈外分支翼腰动脉厂PAX穿线沿其起点结扎，ECA近端备线，用动脉夹暂时阻断CCA及ICA，轻轻向下牵拉ECA残端在 ECA剪一小口，将制备好的直径 0．Zrnm，头端 0．srnm的尼龙插入 ECA，扎紧备线，放开动脉夹，轻轻推进尼龙线，经 CCA分叉处通过ICA人颅至大脑前动脉（ACA人断右侧大脑中动脉（MCA）所有血液来源，尼龙线插人深度距分叉为 18．5。0．snun，缝合皮肤，外留 Icm长尼龙线头。缺血时间为 90分钟。再灌注时轻轻提拉所留线头，至到有阻力时版及尼龙线尖端已至颈外动脉残端。如动物已清醒，需再次麻醉后再灌注。假手术除不插尼龙线外其余步骤同上。 三、免疫组染色：取相邻切片分别进行MMP－9免多抗及MMP上染色。具体步骤： 1．用二甲苯及乙醇处理标本脱石腊 2．3％过氧化氢孵育5分钟，消除内源性过氧化物酶活性 3．蒸馏水冲洗，0．01 MPBS缓冲液冲洗 3次，每次 5分钟。 4．封闭用10％正常羊血清工作液室温孵育10分钟。 5．滴加兔抗鼠 MMP－9 IgG及 MMP－ZIgG一抗工作液问：50稀释）室温孵育过夜。 6．0．01 MPBS缓冲液冲洗 3次，每次 5分钟。 7．滴加生物素标记的第二抗体，37℃孵育30分钟。 8．0．of MPBS缓冲液冲洗 3次，每次 5分钟。 9．滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素37t孵育30分钟。 10．0．01 MPBS缓冲液冲洗 3次，每次 5分钟。 11．滴加新鲜配制 DAB液，观察显色情况。 12．自来水冲洗中止反应。 13．苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中止树胶封片。 14．阴性对照：以 0．01 MPBS置换一抗。 ·2· 四、统计学方法 观察结果以x加形式表示，统计处理用方差撤及t鹏。 实验结果 ＊在阴性对照组中发现MMP－9和MMP—2免疫阳性细胞。 2．在缺血对侧没有MMP－9和MMP－2表达。见图8。 3．MMP－9在小胶质细胞、缺血神经元、内皮细胞、嗜中性粒细胞中表达。阳性细胞为棕黄色淡染细胞。见图二一5。 4．MMP－2在星形细胞、巨噬细胞中表达。阳性细胞为棕黄色染细胞。见图6－7。 5．MMP－9阳性表达细胞数与对照组比较在缺血再灌注6 ／J’时没有明显差别。在缺血融注12小时、24小时在天j天J天均显著增加，其中2天为高峰期，5天J天渐下降。见表1。 6．MMP－2阳性表达细胞数与对照组比较在缺血再灌注6 ／J’时＊2小时没有明显差别，在缺血再灌注12小时、24小时在天j天J天增加显著，其中5天为高峰期，7天渐下降。见表3。 讨 论 本研究提示在MCAO／R后的不同时相，在星形细胞、巨噬细胞中有MMP一工表达；在小胶质细胞、内皮细胞、嗜中粒细胞、缺血神经元有MMP－9表达。免疫组化显示，在正常人CNS中，脑血管内皮细胞星形细胞和小胶质细胞中已经发现 MMP－2和MMP－9。这可以解释正常对照组有少量的MMP一工及M MPMP－9的表达。Anthonr等在脑出血1周内死亡的脑组织标本中发现病灶部位MMP－9明显升高并伴有白细胞浸润，MMP－9抗原定位于多形核白细胞，而MMP－2抗原则定位于单核巨噬细胞。 ·3·Rosenberg等用免疫组化及细胞培养等方法研究再灌注鼠脑中MMPs的细胞定位，结果显示，在不同时相里，MMP－9先后在小胶质细胞、缺血神经元及内皮细胞、嗜中粒细胞、巨噬细胞中出现，而MMP－2染色出现在星形细胞及巨噬细胞中。以上结果不尽相同，可能为免疫组化等实验方法的敏感性不同所至。 本研究发现MMP－2及MMP－9的表达有时间依赖性，MMP－2在 MCAO／R后 6 ／J’时、12 ／