我国烟叶生产每年因病虫害造成的损失近10亿元。烟草青枯病是烟草的重要病害,迄今尚无特效药可治。常规育种受抗源与不良基因连锁和育种年限长等影响,进展慢。随着功能基因组学和生物技术研究的深入研究,转基因烟草将成为选育烟草抗病虫害的有效手段。同时,在转基因安全性得到了普遍的关注后,寻找一条安全有效的转基因育种手段成为当前生物技术育种的热门。本研究在已得到烟草根特异基因和启动子序列,以及受细菌诱导启动子的基础上,构建了特异启动子和诱导启动子驱动抗病基因的表达载体,转入烟草进行功能验证;并对实验室所构建的抗生素自我删除载体进行了验证,结果表明转基因烟草是可能通过基因工程手段来解决其安全性的担忧的。1.根据本实验已获得烟草根特异表达基因NtR12片段,通过合成下游3’ RACE引物,扩增得到3’目的片段,完整了NtR12基因的全长序列;同时对已经得到的NtR12 5’上游的启动子区域进行了生物信息学分析,构建了从启始密码子ATG之前带不同长度启动子片段的表达载体,用于进一步鉴定启动子的结构和功能。2.利用农杆菌叶盘法,将本实验室已构建的抗生素自我删除载体p35S-loxp-Gus转化烟草翠碧一号,在不定芽分化前后,用定量的地塞米松重诱导,培养出转基因烟草。通过对转基因烟草植株进行GUS染色,证实载体在一定浓度的地塞米松诱导下,重组酶Cre-GRB能正确识别loxP位点,删除潮霉素标记基因和重组酶基因表达元件,并使重组DNA,使35S启动子能驱动GUS基因表达,产生蓝色反应。因此该载体可用于将潮霉素基因删除,获得无标记基因的转基因烟草植株。3.同源克隆苦瓜种子的核糖体失活蛋白基因,将已克隆的烟草根特异启动子与核糖体失活蛋白基因融合,构建植物表达载体pSC-NtR12-RIP,转化烟草翠碧一号,对转基因植株进行分子检测和青枯菌接种鉴定,结果表明转基因烟草抗烟草青枯病能力显著提高,以至表达高抗至免疫的水平,并且该基因只在烟草的根和茎部特异表达,不在烟草叶片表达,为解决转基因安全性问题奠定了基础。4.将克隆得到的烟草几丁质酶基因,与受细胞诱导的诱导型启动子结合,构建了植物表达载体pSC-PP1-Chi,通过农杆菌叶盘法侵染烟草翠碧一号,获得了100多株转基因植株,对转基因后代进行PCR检测鉴定得到了上百株阳性转基因植株,对转基因阳性烟草植株进行青枯菌接种鉴定,结果表明在青枯菌诱导下,转基因烟草对青枯病不同程度的提高,至表达高抗水平。