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目的评价羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCTS)及海藻酸钠(Sodium alginate,SA)自交联形成的原位水凝胶(In situ Alginate-Chitosan hydrogel,ACH)的理化性质及其生物学性能,研究原位水凝胶作为角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)的移植载体在角膜碱烧伤中的修复作用。方法用不同浓度的高碘酸钠分别将海藻酸钠氧化,制备成不同氧化度的氧化海藻酸钠(Sodium Alginate Dialdehyde,SAD),SAD的游离醛基在室温下与羧甲基壳聚糖(CMCTS)的游离氨基快速交联制备成海藻酸钠-壳聚糖原位水凝胶,肉眼观察其成胶性状;扫描电镜观察原位水凝胶的表面微观结构,检测其含水量和吸水溶胀率;可见光波长范围(400~800 nm)测量ACH的透光性;MTT实验观察在不同浓度的ACH浸提液中,不同时间段L929小鼠成纤维细胞的增殖活性,进而分析ACH的细胞毒性;小鼠肌肉组织中注射ACH,组织切片苏木精-伊红染色评价其组织相容性,并通过肝、肾及脾指数评价水凝胶在体内的降解毒性。体外培养兔角膜缘干细胞LSCs,Western blot和免疫荧光染色实验筛选并鉴定角膜缘干细胞;MTT实验和活细胞荧光染色实验评价ACH对LSCs的细胞相容性。建立新西兰大白兔的角膜碱烧伤模型,ACH作为移植载体包载角膜缘干细胞LSCs进行角膜碱烧伤的损伤修复,通过外眼像观察及裂隙灯观察、组织切片HE染色和冰冻切片的免疫荧光染色等实验综合评价ACH对角膜碱烧伤的治疗效果。结果在可见光的波长范围内,ACH的透光率均高于70%;扫描电镜显示水凝胶具有良好的多孔不规则网状空间结构,能够为细胞生长繁殖提供良好的微环境;MTT结果显示,在不同浓度、不同时间段的ACH浸提液中,L929小鼠成纤维细胞的相对增殖率(RGR)均达到了80%以上,符合国际生物材料的细胞毒性要求,从而证实ACH的细胞毒性低,符合组织工程材料的毒性要求;小鼠肌肉注射水凝胶,4周左右可见炎症反应基本消失,说明ACH水凝胶在肌肉组织中能够稳定降解,且对肝、肾和脾无明显毒性;Western blot联合免疫荧光染色方法筛选并鉴定LSCs,结果显示p63(角膜缘干细胞LSCs的标志蛋白)阳性率高达90%,而K3+12(角膜上皮细胞的标志性蛋白)阳性率低于20%,说明体外培养的细胞基本为LSCs;细胞活性检测及荧光染色观察到在水凝胶浸提液中,LSCs生长状态与对照组没有显著差异,说明ACH具有良好的细胞相容性;ACH包载LSCs至兔角膜碱烧伤眼表的损伤部位进行原位修复治疗,发现术后28天内基本完成创面修复,角膜几乎呈透明状态且无分泌物排出,修复效果比模型组明显。结论本实验将CMCTS与SAD通过自交联制备成的海藻酸钠-壳聚糖原位水凝胶ACH,具有良好的细胞和组织相容性,且对兔角膜碱烧伤的损伤修复效果显著,为进一步探索组织工程方法治疗角膜碱烧伤提供准确可靠的研究依据。