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研究目的脂联素(adiponectin)是对肥胖及相关代谢性疾病的防治极有价值的分子靶点,一直以来倍受关注。研究膳食脂肪酸的构成对肥胖及相关代谢性疾病(如：糖尿病及胰岛素抵抗)的影响也一直以来是医学界和营养学界关注的热点之一,现有研究也大多数支持改变膳食脂肪酸构成能够改善由肥胖引起的相关代谢性疾病,并且观察到总是伴随着体内脂联素水平的改变。现已知过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator activa ted receptor,PPARγ)是体内脂肪酸的感受器,在调控脂肪细胞分化、调节糖脂代谢中起关键作用；现有研究证明在脂联素基因的启动子上存在PPARγ的反应元件；目前少见关于脂肪酸调节脂联素表达机制的研究,脂肪酸作为PPARγ的天然配体能否通过PPARγ来调节脂联素的表达是非常值得研究的问题。本实验拟通过体外细胞培养试验,从不同种类脂肪酸对脂联素表达的影响这一角度来展开研究,寻找能提高脂联素的表达的适宜脂肪酸种类和浓度,为日后研究不同脂肪酸构成比提供初步数据,并初步探讨不同脂肪酸调节脂联素表达的分子机理。其研究结果将为肥胖相关疾病的预防和治疗提供新的思路和科学依据,也为确定膳食中不同脂肪酸的适宜构成提供新的重要的参考依据,有重要的理论价值和现实意义。研究方法1以体外培养并诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,以棕榈酸(PA)、油酸(OA)、亚油酸(LA)为受试物,观察经一定浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的不同脂肪酸处理后,3T3-L1脂肪细胞脂联素及PPARγ基因表达水平的变化(Realtime PCR相对定量法),观察各受试物是否通过PPARγ来影响脂联素的表达；2观察比较不同脂肪酸加抑制剂(GW9662:PPARy抑制剂)或不加抑制剂对脂肪细胞脂联素基因、PPARγ基因和脂联素蛋白表达水平的影响。3所得数据采用平均数±标准差(x±s)表示,如果方差齐,组间比较采用单因素方差分析(One WayANOVA),两两比较采用LSD T-test或dunnett T-test,如果方差不齐,运用Welch法和Dunnett’s T3法分别进行组间比较和两两比较。相关性分析采用Pearson相关分析。研究结果1. PA、OA、LA对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响1.1PA对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的PA分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,在浓度为25μmol/L时脂联素mRNA表达显著增加,比对照组增加54%(P=0.035)；其余浓度脂联素mRNA表达均下降,在400μmol/L(?)寸显著降低,比对照组降低75%(P=0.001)。在浓度为25、50μmol/L时,PPARy mRNA表达显著增加,与对照组相比分别增加63%(P=0.006)和71%(P=0.002)；其余浓度时表达均下降,在400μmol/L时,比对照组降低79%(P=0.001)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.882,P=0.000。1.2OA对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的OA分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,在浓度为25、50、100μmol/L时,脂联素mRNA的表达均高于对照组,在50μmol/L时最为显著,比对照组增加80%(P=0.008)；随着浓度的增加,脂联素mRNA表达下降,在400μmol/L时显著低于对照组,减少55%(P=0.007)。在浓度为25、50、100μmol/L时,PPARγ mRNA的表达增加,在50μmol/L显著增加,比对照组增加39%(P=0.014)；随着浓度的继续增加,PPARγ mRNA表达均下降,在200、400μmol/L时,分别比对照组减少39%(P=0.013)和57%(P<0.05)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.971,P=0.000。1.3LA对脂联素及PPARγ mRNA表达的影响以不同浓度(25、50、100、200、400μmol/L)的LA分别处理3T3-L1成熟脂肪细胞24h,在浓度为50、100μmol/L时脂联素mRNA的表达显著增加,分别比对照组增加199%(P<0.001)和118%(P<0.001)；当浓度为400μmol/L时,表达显著下降,比对照组减少59%(P=0.006)。在浓度为25、50、100μmol/L时,PPARγ mRNA的表达增加并呈上升趋势,分别比对照组增加117%(P=0.001)、128%(P=0.001)、181%(P<0.001)；当浓度为200、400μmol/L时,PPARy mRNA表达下降,其中400μmol/L时显著低于对照组,减少83%(P=0.021)。经Pearson相关分析,脂联素mRNA表达与PPARγ mRNA表达总体趋势存在显著正相关关系。相关系数r=0.830,P=0.000。2.浓度为100μmol/L时PA、OA、LA对脂联素、PPARγ mRNA和脂联素蛋白表达水平影响的比较以100μmol/L浓度的PA、OA、LA分别处理成熟脂肪细胞24h。PA处理组脂联素mRNA显著低于对照组,比对照组减少67%(P=0.011),而PPARγ mRNA表达则与对照组相比没有显著性差异；OA处理组与对照组相比,脂联素nRNA、 PPARγ mRNA表达变化均无显著性差异；LA处理组与对照组相比,脂联素mRNA表达增加58%(P=0.022),PPARγ mRNA表达增加102%(P=0.013)。以100μmol/L浓度的PA、OA、LA分别处理成熟脂肪细胞24h。PA处理组和OA处理组脂联素蛋白表达与对照组相比均无显著性差异；LA处理组与对照组相比,脂联素蛋白表达增加110%(P<0.001)。3. PPARy拮抗剂GW9662对脂肪细胞脂联素及PPARy mRNA和脂联素蛋白表达水平影响的比较在100μmol/L浓度的PA、OA、LA中分别加入100、mol/L PPARy拮抗剂GW9662处理成熟脂肪细胞24h。PA处理组脂联素mRNA、PPARγmRNA表达均显著下降,分别为比对照组减少79%(P<0.001)、85%(P<0.001)；OA处理组脂联素mRNA、PPARγmRNA表达分别比对照组减少77%(P<0.001)、74%(P<0.001)；LA处理组脂联素mRNA、PPARγmRNA表达分别比对照组减少89%(P<0.001)、82%(P<0.001)。在100μmol/L浓度的PA、OA、LA中分别加入100μmol/L PPARy拮抗剂GW9662处理成熟脂肪细胞24h。PA处理组脂联素蛋白表达显著下降,比对照组减少88.77%(P<0.001)；OA处理组脂联素蛋白的表达与对照组相比也显著下降,比对照组减少78.01%(P<0.001)；LA处理组脂联素蛋白表达比对照组减少95.83%(P<0.001)。结论1.油酸和亚油酸在一定浓度范围内上调3T3-L1脂肪细胞脂联素和PPARy基因的表达；棕榈酸则主要表现为抑制作用,但在很低浓度(25μmol/L)时也能上调脂联素及PPARy基因的表达。2.经相关性分析发现,脂联素与PPARy基因表达之间存在显著正相关关系,提示不同脂肪酸影响脂联素的表达有可能通过激活或抑制PPARy的表达来实现。PPARy抑制剂GW9662能够特异性的阻断不同脂肪酸对脂联素表达的影响。3.本研究结果提示脂肪酸的种类、浓度等都是影响脂联素表达的重要因素,并有可能通过调整膳食脂肪酸种类、构成、数量等来增加脂联素的表达和分泌,发挥其有益作用。