背景膀胱癌是最为常见的泌尿系恶性肿瘤,是危害人类健康的重要问题之一。在世界范围内,膀胱癌的发病率在所有恶性肿瘤中位居第十。据全球数据统计,2018年估计约有549000例新病例和200000例死亡病例。其中,男性发病率约为女性的3倍。在美国仅2019年,约80470例患者(男性61700名)被诊断为膀胱癌,17670例患者(男性12870例)死于膀胱癌,其发病率在男性恶性肿瘤中排名第四,死亡率排名第八。与欧美国家相比,我国膀胱癌的发病率相对较低。但近年来随着社会的老龄化、人们生活方式的丰富、许多新型生物标记物的发现以及影像技术的发展,我国膀胱癌的发病率及检出率呈明显快速上升的趋势。绝大部分膀胱癌为尿路上皮癌,其肿瘤生物学行为复杂,遗传亚型多样,易复发、易转移,引起目前临床诊疗的困难。因此,通过分子机制的深入研究找到诊断与治疗的新靶点成为膀胱癌研究的热点。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m~6A)指的是腺嘌呤碱基6位N上的甲基化修饰,在70年代首次被发现,是富含在真核细胞m RNA中最常见的一种RNA内部修饰。随着检测技术与研究技术的进步,m~6A逐渐被发现在生物个体生长发育、精子发育与成熟、DNA损伤修复、生物节律等一些生理病理过程中发挥着重要的作用。m~6A修饰是一种动态且可逆的转录后修饰过程,由“书写者”——多组分的甲基转移酶复合物(METTL3,METTL14及其辅因子如WTAP等)进行甲基化,并由“橡皮擦”——去甲基酶(FTO和ALKBH5)去除。m~6A修饰最终对目标m RNA产生何种影响取决于行使功能的阅读蛋白,包括YT521-B同源性(YTH)域家族(YTHDF1-3,YTHDC1-2)和IGF2 m RNA结合蛋白家族。YTHDF2的识别可以诱导m RNA降解,YTHDF1和YTHDF3的结合可以启动含m~6A转录物的翻译,而通过IGF2BP家族鉴定可以促进靶m RNA的稳定性。目前已有研究表明,m~6A核心修饰蛋白以及阅读蛋白的异常表达引起的m~6A修饰改变与肿瘤的发生发展有关,但其与膀胱癌的内在机制仍不明确。目的:检测METTL3和YTHDF2在膀胱癌细胞株中的表达模式,研究二者对膀胱癌m~6A修饰水平的影响,并进一步探索m~6A修饰水平改变所引起的表观遗传学调控机制。采用功能实验观察METTL3/YTHDF2 m~6A轴在膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3中的生物学功能。利用转录组测序、生物信息学预测、甲基化RNA免疫共沉淀实验与RNA免疫共沉淀实验寻找并验证METTL3/YTHDF2 m~6A轴的直接作用靶点,通过分析靶点基因SETD7的生物学功能,验证METTL3/YTHDF2 m~6A轴的调控机制及价值,研究这一m~6A轴潜在的下游分子信号通路。方法:1)通过TCGA数据库评估m~6A修饰通路核心蛋白METTL3、YTHDF2在膀胱癌组织中的表达模式,并在膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3中进行验证,分析其潜在的生物学作用;2)通过转染干扰RNA(si RNA)抑制METTL3、YTHDF2的表达水平后,用CCK-8试验、Colony平板克隆试验、流式细胞周期仪器检测、Trans-well试验以及伤口愈合划痕试验等来探索METTL3/YTHDF2 m~6A轴的异常表达对于细胞增殖和细胞迁移的影响;并通过慢病毒感染构建稳定低表达METTL3的UM-UC-3细胞稳转株用于裸鼠皮下移植瘤模型与尾静脉转移模型进行体内验证。3)利用转录组测序、生物信息学在线预测网站分析和预测METTL3/YTHDF2m~6A轴的下游靶基因,利用q PCR、Western Blot和免疫组化等证实靶基因表达水平的变化,并利用RNA甲基化免疫沉淀试验与RNA免疫沉淀试验验证METTL3/YTHDF2 m~6A轴的下游靶基因,并敲低或过表达靶基因进行实验明确下游作用机制。结果:1)根据TCGA数据库显示,METTL3、YTHDF2在膀胱癌中表达量显著升高,且升高的表达量也在膀胱癌细胞系中得到了验证。同时,我们利用相关性分析发现METTL3与YTHDF2的表达存在相关性(r=0.2036,p<0.0001),因此推测YTHDF2可以阅读由METTL3甲基化的m RNA。2)敲低METTL3显著抑制了膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力。稳定干扰METTL3的表达可抑制裸鼠UM-UC-3细胞株皮下移植瘤的生长以及肿瘤细胞通过裸鼠尾静脉的转移。此外,敲低METTL3可逆转膀胱癌细胞中的EMT进程。这些结果提示我们METTL3可能在膀胱癌的发生发展中发挥着重要的促癌作用。3)同时,敲低YTHDF2的表达量能够显著抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。并且敲低YTHDF2也可逆转膀胱癌细胞中的EMT进程。这些结果提示我们YTHDF2可能作为METTL3甲基化修饰后的阅读蛋白之一,在膀胱癌的发生发展中发挥着重要的促癌作用。4)通过转录组测序与生物信息学分析,发现SETD7基因为METTL3/YTHDF2m~6A轴的潜在作用靶点。通过RNA甲基化免疫沉淀试验和RNA免疫沉淀试验验证,METTL3/YTHDF2 m~6A轴可直接降解SETD7基因的m RNA,从而调控SETD7基因的表达。5)此外,过表达SETD7基因能够逆转膀胱癌细胞中的EMT进程,明显地阻碍膀胱癌细胞的迁移以及侵袭。这些结果提示我们SETD7基因在膀胱癌的进展中发挥着重要的抑癌作用。结论:1)与正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1相比,METTL3、YTHDF2在膀胱癌细胞系T24、UM-UC-3中表达量显著升高。且METTL3与YTHDF2的表达具有一定的相关性,提示YTHDF2可为METTL3 m~6A修饰通路中的阅读蛋白。2)敲低METTL3能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力。此外,敲低METTL3可通过抑制AKT2/Snail通路来逆转膀胱癌细胞中的EMT进程。3)敲低YTHDF2的表达量能够显著抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力。并且敲低YTHDF2也可逆转膀胱癌细胞系中的EMT进程。4)METTL3/YTHDF2 m~6A轴可以直接降解SETD7基因的m RNA,从而抑制SETD7基因在膀胱癌中的表达。5)过表达SETD7基因能够逆转膀胱癌细胞中的EMT进程,显著抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭,提示其在膀胱癌的进展中发挥着重要的抑癌作用。