研究背景叉头框转录因子F2（forkhead box F2,FOXF2）属于间充质转录因子,在胚胎发育和维持组织稳态过程中起关键作用。课题组前期研究证实FOXF2特异性表达于基底样乳腺癌（basal-like breast cancer,BLBC）细胞中,而FOXF2表达缺乏的BLBC细胞通过转录上调上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关转录因子如TWIST1、FOXC2和FOXQ1的表达获得间充质细胞表型并早发内脏转移。但是,FOXF2调控BLBC内脏转移的分子机制尚未完全阐明。上皮-肌成纤维细胞转化（epithelial-myofibroblast transition,EMyo T）通过激活肌源性基因的表达诱导肿瘤细胞获得肌成纤维细胞样（myofibroblast-like）或肿瘤相关成纤维细胞样（cancer-associated fibroblast-like,CAF-like）的表型。研究证实TGF-β/SMAD信号通路可以通过诱导EMyo T促进肿瘤内脏转移。我们进一步研究发现FOXF2在BLBC细胞中转录抑制转化生长因子-β2（transforming growth factor-β2,TGF-β2）和TGF-β3表达,提示FOXF2可能调控TGF-β/SMAD信号通路活性;TGF-β/SMAD信号通路还可抑制FOXF2蛋白表达,但并不影响其m RNA表达,micro RNA可以通过转录后调控基因表达,而FOXF2是多种micro RNA如miR-19a-3p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-200b-3p或miR-301-3p的靶基因,提示micro RNA可能介导TGF-β/SMAD信号通路对FOXF2表达的调节作用。因此,我们推测FOXF2和TGF-β/SMAD信号通路之间可能存在负反馈调节环,进而促进BLBC细胞的EMyo T和内脏转移。目的本研究旨在证实FOXF2与TGF-β/SMAD信号通路间的相互调节及其在BLBC内脏转移中的作用和机制。研究方法1.在Basal-like亚型乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549中分别沉默FOXF2表达和过表达FOXF2,在Luminal亚型乳腺癌细胞MCF7中异位表达FOXF2。通过双荧光素酶报告系统和Western blot检测SMAD转录活性以及p-SMAD2和p-SMAD3蛋白表达水平;通过RT-q PCR、Western blot和免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测TGF-β2和TGF-β3 m RNA和蛋白的表达;通过Ch IP-PCR、Ch IP-q PCR和双荧光素酶报告系统实验检测FOXF2对靶基因TGFB2和TGFB3的结合及对其转录活性的调节作用。2.为了研究自分泌TGF-β/SMAD信号通路是否介导FOXF2低表达的BLBC细胞获得肿瘤相关成纤维细胞样（cancer-associated fibroblast-like,CAF-like）表型,采用TGF-β/SMAD信号通路的抑制剂SB431542处理FOXF2沉默表达的MDA-MB-231细胞,或采用TGF-β2和TGF-β3处理FOXF2过表达的BT549细胞。然后通过细胞三维培养、F-Actin染色、胶原收缩、划痕、Transwell实验检测BLBC细胞侵袭分枝的形成、F-Actin聚合能力、收缩能力、迁移和侵袭的能力;通过Western blot检测CAF标志物α-SMA、FAP、Fibronectin和PDGFRβ的表达。3.为了研究自分泌TGF-β/SMAD信号通路是否介导FOXF2低表达对BLBC细胞内脏转移的调控作用,将携FOXF2 sh RNA的慢病毒及其对照慢病毒感染MDA-MB-231-Luc（231-Luc）细胞,用嘌呤霉素筛选稳定沉默FOXF2表达的细胞（231-Luc-sh FOXF2）及其对照细胞（231-Luc-sh Control）,然后分别接种于雌性严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠右下乳腺脂肪垫。231-Luc-sh Control细胞接种SCID小鼠5只,231-Luc-sh FOXF2细胞接种SCID小鼠10只,接种231-Luc-sh FOXF2细胞组别的SCID小鼠随机选择5只每天腹腔注射TGF-β/SMAD信号通路抑制剂SB431542（10mg/kg）,注射六周。通过活体成像观察荷瘤小鼠肿瘤的转移情况;Kaplan-Meier生存分析统计荷瘤小鼠的生存期;原位接种第50天处死所有小鼠,取肝、肺、胰腺和肾脏组织,经4%甲醛固定、石蜡包埋制备组织切片、H&E染色,组织学鉴定各脏器的转移状态;IHC检测荷瘤小鼠原发肿瘤组织中CAF标志物α-SMA、FAP、Fibronectin和PDGFRβ的表达。4.为了研究旁分泌TGF-β/SMAD信号通路是否介导FOXF2低表达的BLBC细胞对临近肿瘤细胞生物学行为的调控作用,采用慢病毒感染和嘌呤霉素抗性筛选稳定沉默表达FOXF2和过表达FOXF2的带有GFP标签的乳腺癌细胞及其对照细胞（231-sh FOXF2、231-sh Control、BT549-FOXF2和BT549-Vector）,以及带有RFP标签的乳腺癌细胞（231-red和BT549-red）。收集231-sh FOXF2和BT549-FOXF2及其对照细胞的上清分别诱导培养MDA-MB-231或BT549细胞或者将231-sh FOXF2和BT549-FOXF2及其对照细胞分别与231-Red或BT549-Red混合培养。然后通过Western blot检测被诱导的BLBC细胞中p-SMAD2/3和EMT相关蛋白的表达;通过划痕和Transwell实验检测被诱导的BLBC细胞的迁移和侵袭能力。5.为了研究旁分泌TGF-β/SMAD信号通路是否介导FOXF2低表达的BLBC细胞对临近肿瘤细胞内脏转移的调控作用,将2.5×105个231-sh FOXF2或231-sh Control细胞分别与2.5×105个231-Luc细胞混合后原位接种于雌性SCID小鼠右下乳腺脂肪垫。231-sh Control细胞与231-Luc细胞混合后接种SCID小鼠5只,231-sh FOXF2细胞与231-Luc细胞混合后接种SCID小鼠10只,混合接种231-sh FOXF2细胞和231-Luc细胞组别的SCID小鼠随机选择5只每天腹腔注射抑制剂SB431542（10mg/kg）,注射六周。活体成像观察荷瘤小鼠肿瘤的转移情况;Kaplan-Meier生存分析统计荷瘤小鼠的生存期;原位接种第60天处死所有小鼠,取肝、肺、胰腺和肾脏组织,经4%甲醛固定、石蜡包埋制备组织切片、H&E染色,组织学鉴定脏器的转移;IHC检测荷瘤小鼠原发肿瘤组织中CAF标志物α-SMA、vimentin、Fibronectin和PDGFRβ的表达。6.为了研究TGF-β/SMAD信号通路调节FOXF2表达的分子机制,采用TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3诱导MDA-MB-231细胞,然后通过RT-q PCR和Western blot检测FOXF2及其上游micro RNA（miR-19a-3p、miR-96-5p、miR-182-5p、miR-200b-3p和miR-301-3p）的表达,筛选介导TGF-β调节FOXF2的micro RNA;通过双荧光素酶报告系统检测候选micro RNA对FOXF2 3’UTR活性的调节作用;通过RT-q PCR和Western blot检测转染候选micro RNA模拟物和micro RNA抑制剂对FOXF2表达的影响。7.为了研究TGF-β/SMAD信号通路和FOXF2是否直接转录调控候选micro RNA表达,通过Ch IP-q PCR验证SMAD3和FOXF2与候选micro RNA启动子的结合;通过双荧光素酶报告系统检测SMAD3和FOXF2对候选micro RNA转录活性的调节作用;RT-q PCR检测沉默表达FOXF2和过表达FOXF2对候选micro RNA表达的影响。结果1.在MDA-MB-231细胞中沉默表达FOXF2后SMAD的转录活性增强,SMAD2和SMAD3的磷酸化水平增加;在BT549细胞中过表达FOXF2后SMAD的转录活性降低,SMAD2和SMAD3的磷酸化水平降低;在MCF7细胞中异位表达FOXF2后SMAD的转录活性无显著变化,SMAD2和SMAD3的磷酸化水平无显著变化。RT-q PCR、Western blot和IHC结果表明在BLBC细胞中FOXF2抑制TGF-β2和TGF-β3 m RNA和蛋白表达;TGFB2和TGFB3基因的启动子序列分析显示,TGFB2启动子-1054 bp至-1047 bp区域和TGFB3启动子的-1476 bp至-1469bp区域为FOXF2的经典结合位点;Ch IP-PCR和Ch IP-q PCR结果证实在BLBC细胞中FOXF2可以结合到TGFB2和TGFB3基因启动子上;双荧光素酶报告系统结果表明FOXF2抑制TGFB2和TGFB3基因的转录活性。证实在Basal-like亚型乳腺癌细胞中FOXF2通过转录抑制TGFB2和TGFB3表达抑制TGF-β/SMAD信号通路;在Luminal亚型乳腺癌细胞中FOXF2不调控TGFB2和TGFB3表达,同样不调控TGF-β/SMAD信号通路。2.在MDA-MB-231细胞中沉默表达FOXF2可以促进细胞的侵袭分枝形成,增强细胞的F-Actin聚合能力、胶原收缩能力和细胞迁移侵袭能力,并上调CAF标志物的表达,抑制剂SB431542可逆转FOXF2沉默表达所诱导的细胞生物学行为的改变;在BT549细胞中过表达FOXF2可以抑制细胞的侵袭分枝形成、F-Actin聚合能力、胶原收缩能力和细胞迁移侵袭能力,并下调CAF标志物的表达,而用TGF-β2和TGF-β3处理后可以逆转FOXF2过表达所导致的细胞生物学行为的改变。证实FOXF2低表达通过调控TGF-β/SMAD信号通路促进BLBC细胞获得CAF-like表型。3.动物实验显示231-Luc-sh FOXF2荷瘤小鼠内脏转移较对照组显著增加,生存时间显著减少,原发肿瘤组织中CAF标志物（α-SMA、FAP和PDGFRβ）和p-SMAD3的表达显著上调,表明肿瘤细胞通过激活TGF-β/SMAD信号通路获得CAF-like表型,进而促进肿瘤的内脏转移。小鼠腹腔注射抑制剂SB431542显著减少内脏转移,延长小鼠的生存时间以及下调CAF标志物表达。证实FOXF2低表达通过调控TGF-β/SMAD信号通路促进BLBC内脏转移。4.MDA-MB-231细胞被231-sh FOXF2细胞的上清诱导后,细胞中p-SMAD2、p-SMAD3和间质标志物表达较对照组显著上调,细胞的迁移和侵袭能力显著增强,划痕实验结果表明231-sh FOXF2细胞可以增强231-Red细胞的迁移能力,抑制剂SB431542可以逆转231-sh FOXF2细胞所诱导的MDA-MB-231细胞表型的改变;BT549细胞被BT549-FOXF2细胞的上清诱导后,细胞表型的改变与上述结果相反,TGF-β2和TGF-β3可以逆转BT549-FOXF2细胞所导致的BT549细胞表型的改变。证实FOXF2低表达的BLBC细胞通过旁分泌TGF-β2和TGF-β3激活临近肿瘤细胞中TGF-β/SMAD信号通路,进而促进临近肿瘤细胞的迁移和侵袭。5.动物实验显示混合接种231-sh FOXF2和231-Luc细胞的荷瘤小鼠内脏转移较对照组显著增加,生存时间显著减少,原发肿瘤组织中间质标志物（α-SMA、fibronectin和vimentin）和p-SMAD3的表达显著上调,表明肿瘤细胞中TGF-β/SMAD信号通路激活,进而促进肿瘤的内脏转移。小鼠腹腔注射抑制剂SB431542显著减少内脏转移,显著延长小鼠的生存时间以及下调CAF标志物表达。证实FOXF2低表达的BLBC细胞通过调控旁分泌TGF-β/SMAD信号通路促进临近BLBC细胞的内脏转移。6.TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3诱导BLBC细胞后,细胞中FOXF2蛋白表达下调,FOXF2 m RNA表达无显著变化,FOXF2上游的micro RNA中miR-182-5p和miR-200b-3p表达上调,miR-301-3p表达下调,miR-19a-3p和miR-96-5p表达无显著变化;荧光素酶报告系统结果表明在BLBC细胞中miR-182-5p抑制FOXF2 3’UTR活性;RT-q PCR和Western blot结果显示在BLBC细胞中miR-182-5p抑制FOXF2蛋白表达但不影响FOXF2 m RNA表达;在BLBC细胞中miR-182-5p inhibitor可以逆转TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3所诱导的FOXF2蛋白表达的下调。证实TGF-β/SMAD信号通路通过调节miR-182-5p表达抑制FOXF2蛋白表达。7.miR-182基因的启动子序列分析显示,miR-182启动子–452bp至–445bp区域为FOXF2的经典结合位点,miR-182启动子–255bp至–252bp和–50bp至–41bp区域为SMAD3的经典结合位点;Ch IP-q PCR结果证实在BLBC细胞中SMAD3和FOXF2可以结合到miR-182启动子上,而且TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3增强SMAD3和miR-182启动子的结合,SB431542抑制SMAD3和miR-182启动子的结合;双荧光素酶报告系统结果显示在BLBC细胞中TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3增强miR-182启动子的转录活性,SB431542抑制miR-182启动子的转录活性,FOXF2抑制miR-182启动子的转录活性;RT-q PCR结果显示在BLBC细胞中FOXF2抑制miR-182-5p表达。证实在BLBC细胞中TGF-β/SMAD信号通路通过增强miR-182的转录活性上调miR-182-5p表达,FOXF2通过抑制miR-182的转录活性下调miR-182-5p表达。结论1.在Basal-like亚型乳腺癌细胞中FOXF2通过转录抑制TGFB2和TGFB3表达抑制TGF-β/SMAD信号通路;在Luminal亚型乳腺癌细胞中FOXF2不调控TGFB2和TGFB3表达,同样不调控TGF-β/SMAD信号通路。2.FOXF2低表达通过激活TGF-β/SMAD信号通路诱导BLBC细胞获得CAF-like表型,从而促进BLBC细胞的内脏转移。3.FOXF2低表达的BLBC细胞通过旁分泌细胞因子TGF-β2和TGF-β3激活临近BLBC细胞内TGF-β/SMAD信号通路,从而诱导临近BLBC细胞内脏转移。4.在BLBC细胞中,FOXF2与miR-182-5p以及TGF-β/SMAD/miR-182-5p调节轴之间存在负反馈调节环,进而加速BLBC内脏转移。