论文部分内容阅读
植物在特定时间开花是长期适应环境的结果,开花品质既是观赏性状又是栽培特性。菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat)为我国的传统名花,大多数传统菊花品种为秋菊和寒菊,为典型的短日植物。对长日和短日植物成花调控机理研究发现,昼夜节律钟基因感受日照信号长短并将日长信号转变为开花信号。通过有效操纵昼夜节律钟及下游成花关键基因,可以培育出自然花期适合周年产业化生产的具有自主知识产权的菊花新品种。由于菊花遗传背景复杂,因此针对菊花开花调控机理的研究进展缓慢。本文作者以参与菊花起源物种之一的二倍体植物甘菊[C. lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino]作为研究的模式植物材料,在对光周期诱导甘菊开花特性进行充分研究的基础上,利用甘菊转录组及表达谱数据分析的结果,对昼夜节律钟及下游CO和FT基因进行分离并对其表达规律进行研究,在此基础上对关键基因进行转基因研究,以期获得短日照诱导甘菊成花转变的分子机理,为菊花花期改良的分子育种奠定理论基础。本研究获得了以下主要结果：(1)通过对光周期诱导甘菊开花特性进行研究发现甘菊为典型的短日植物,临界光周期为13h光照/11h黑暗。甘菊幼龄期结束时叶龄为14片真叶。甘菊接受22d短日照(12h光照/12h黑暗)处理后即使随后处于长日照条件(16h光照/8h黑暗)下也能顺利完成开花过程,因此甘菊限界性光周期为22d短日照。当光周期的暗期长度达到12h(16h光照/12h黑暗和8h光照/12h黑暗)时,无论光照时间延长还是缩短,甘菊均能在14.25-16.25个循环处理后顺利现蕾,38.45-40.25个循环处理后开花。因此甘菊是严格的短日植物,暗期长度和短日照处理时间是影响其顺利成花的关键因素。(2)通过对甘菊短日照诱导条件数字表达谱中表达相对稳定的9个内参候选基因采用实时荧光定量PCR技术,分析其在甘菊不同发育时期不同组织及不同光周期处理条件下叶片中的表达稳定性,筛选得到甘菊不同发育时期不同组织中表达最为稳定的SAND基因和不同光周期处理条件下叶片中表达最为稳定的MTP基因,为后续相关基因表达模式分析奠定了基础。(3)通过对甘菊转录组数据库进行分析,结合RACE技术共分离得到11个甘菊昼夜节律钟相关同源基因。通过对其在不同组织中的表达规律进行研究发现,除ClELF3、ClPRR1和ClPRR73基因外,大多数昼夜节律钟基因均在叶片中高表达。通过对长日照(16h光照/8h黑暗)和短日照(12h光照/12h黑暗)条件下昼夜节律钟基因表达规律进行研究,发现其昼夜节律表达模式与拟南芥中昼夜节律钟基因表达模式类似。甘菊中昼夜节律钟基因在持续光照条件下基本能维持昼夜节律振荡的特性,但振荡周期有所改变,振幅降低,表明昼夜节律钟基因还受外界环境条件如光照的调节。暗中断处理条件(12h光照/12h黑暗的暗期中间阶段给予2h白光处理)下,ClGIs基因在光照后2h表达高峰完全消失,ClFKF1基因表达量下降,而在非诱导的8h光照/8h黑暗条件下CIFKF1基因表达高峰完全消失,而CIGIs基因的表达量没有明显改变,表明ClFKF1基因与ClGIs基因或单独发挥作用或形成复合物影响甘菊开花时间。对昼夜节律钟输出基因ClGI-1进行转基因研究发现,过表达ClGI-1基因的拟南芥转基因植株开花提前,并且CO和FT基因的表达水平上升,推测ClGI-1基因在甘菊中可能通过促进CO和FT相关同源基因的表达促进成花。(4)利用甘菊转录组数据库信息,结合RACE技术共分离得到11个甘菊CO同源基因,分别命名为ClCOL1-11基因。组织特异性表达结果表明,ClCOL1-5和ClCOL10-11基因均在叶片和茎尖中高量表达,短日照诱导条件下ClCOL4-5基因和ClCOL7-8基因的表达水平显著高于长日照条件下的表达水平。通过对CICOL1基因进行功能研究发现,其不仅可以促进开花,而且在控制株型、株高和开花持续期方面发挥作用。ClCOL5基因仅能促进拟南芥成花,并且其促进成花作用比ClCOL1基因更明显。这一结果表明CICOL5基因与甘菊成花诱导过程密切相关,在甘菊中发挥促进成花的作用,而ClCOL1基因可能冗余地与ClCOL5基因发挥促进开花的功能。(5)利用甘菊转录组数据库信息,结合RACE技术共分离得到2个FT同源基因,分别命名为ClFT1基因和ClFT2基因。组织特异性表达分析表明ClFT1基因在叶片中的表达量高于茎尖,ClFT2基因在茎尖中的表达量高于叶片。短日照诱导条件下ClFT1基因持续上升,ClFT2基因持续下降。转基因研究结果表明,ClFT1基因促进拟南芥成花转变,ClFT2基因抑制拟南芥成花转变,表明其在甘菊成花转变过程中发挥相反的功能。综合上述研究结果我们得出了本研究的主要结论：甘菊为严格短日植物,暗期长度和短日照处理时间决定其成花与否。光暗的昼夜交替使甘菊昼夜节律钟基因表达保持稳定的昼夜节律,当暗期长度超过其临界夜长时,ClGIs基因在光照的开始阶段高量表达进而激活ClCOL4/5基因和ClFT1基因表达,而ClFKF1或与ClGIs基因形成复合物间接抑制ClFT2基因表达,当ClFT1基因表达量远远超过ClFT2基因时,甘菊即可启动成花转变过程。本研究为研究菊科植物测量日长的分子机制奠定了重要的理论基础,同时也为通过人工操纵昼夜节律钟基因及下游开花基因进而改变菊花花期提供了新思路。