一、背景与目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种发病率和致死率都很高的恶性肿瘤,复发转移是影响肝细胞癌病人长期生存的根本原因。因此,深入研究肝细胞癌发生、发展和转移的分子机制,筛选预防和治疗肝细胞癌的关键靶点具有十分重要的理论意义和临床价值。Aurora-A是新近发现的丝氨酸/苏氨酸激酶家族的一个重要分子,通过控制中心体复制和分离参与有丝分裂过程的调控,在肝细胞癌等多种恶性肿瘤中均呈高表达状态。前期研究表明:Aurora-A基因的表达水平与肝细胞癌患者的临床分期、淋巴结转移及其预后密切相关,阻断其表达可在体内外有效抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡,显示了其作为肿瘤生物治疗靶点的潜在应用价值。MicroRNA (miRNA)是一类非编码小分子RNA,可在转录后水平上负向调控基因的表达,广泛影响不同的分子信号通路,参与对细胞生长、分化、凋亡及肿瘤生长和转移等过程的调控。本研究旨在探寻miRNA对人肝细胞癌中Aurora-A基因表达的调节作用,利用生物信息学方法和荧光素酶活性试验筛选并验证肝细胞癌中诱导Aurora-A基因过表达的关键microRNA分子,分析其在肝细胞癌组织和细胞中的表达水平及临床意义,并通过体内外实验探索其在肝细胞癌发生发展中的功能和分子机制,为进一步阐明和完善肝细胞癌中Aurora-A基因表达水平升高及其功能异常的分子调控机制,寻找肝细胞癌新的治疗靶点提供实验依据。二、材料、方法与结果第一部分肝细胞癌中负向调控Aurora-A基因表达的miRNA分子的筛选和鉴定方法:1.利用四个不同的miRNA 基因在线分析软件:①TargetScanHuman 6.0(http://www.targetscan.org)、 ② PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/)、 ③microRNA.org(http://www.microrna.org)和 ④ miRNA targets(http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer),分析Aurora-A基因3’-末端非编码序列中所有潜在的miRNA结合位点,并将预测结果作交集分析。2.合成1中预测出来的60个miRNA的mimics,分别转染含有Aurora-A基因3’-UTR序列的HEK293T细胞,并进行荧光素酶活性测定,根据荧光素酶活性变化筛选能够与Aurora-A基因3’-UTR序列结合的miRNA。3.合成2中鉴定出来的8个miRNA的mimics,运用western blot技术验证它们对Aurora-A的调控作用。结果:1.通过生物信息学软件和交集分析可知,同时被3个及3个以上miRNA/靶基因数据在线分析软件预测到的miRNA共有60个。2.能使荧光强度显著下降的miRNA有8个,分别为let-7a,miR-124,miR-129-3p,miR-140-5p,miR-153-3p,miR-363-3p, miR-885-3p和miR-92a-3p。3.能靶向调控Aurora-A表达的miRNA共有6个,分别为miR-129-3p , miR-140-5p,miR-153-3p,miR-363-3p,miR-885-3p和miR-92a-3p。第二部分miR-129-3p在肝细胞癌中的表达及临床意义方法:1.选定miR-129-3p为研究对象,在转移能力不同的一系列人肝细胞癌细胞(HepG2、BEL-7402、HCCLM3和MHCC97-H)中运用实时定量RT-PCR检测miR-129-3p的表达水平。2.收集88例原发性肝细胞癌组织和对应的癌旁组织,从中选取20例,运用实时定量RT-PCR检测miR-129-3p表达水平,运用实时定量RT-PCR和western blot检测Aurora-A表达水平,并分析两者之间的关系。进一步在全部88例原发性肝细胞癌组织和对应癌旁组织中通过通过免疫组化染色分析Aurora-A的阳性率差异以及其与miR-129-3p表达水平的关系。3.在全部88例原发性肝细胞癌组织中结合临床信息分析miR-129-3p表达水平与临床病理特征和预后的关系。结果:1.在正常肝细胞株HH中,miR-129-3p的表达水平最高,低侵袭性肝癌细胞株HepG2和BEL-7402次之,高侵袭性肝癌细胞株HCCLM3和MHCC970-H中,miR-129-3p的表达水平最低(p<0.01)。2.与对应癌旁组织相比,20例肝细胞癌组织中Aurora-A的mRNA和蛋白表达水平,明显增高,而miR-129-3p表达水平却呈显著下降(p<0.01); MiR-129-3p与Aurora-AmRNA的表达呈负相关(r =-0.221 ;p=0.0001)。与对应癌旁组织相比,88例肝细胞癌组织中Aurora-A的阳性率明显增高;弱阳性组中miR-129-3p的表达水平显著高于中度阳性或强阳性组(p<0.01 )。提示肝细胞癌组织中Aurora-A的高表达与miR-129-3p的低表达显著相关。3.在肝细胞癌临床组织样本中,miR-129-3p的表达水平与患者TNM分期(p=0.001)、淋巴结转移(p=0.022)、血管侵袭(p=0.036)以及肿瘤复发(p=0.001)呈显著相关;采用Kaplan-Meier生存曲线分析发现,低miR-129-3p表达水平预示总生存期(p<0.001)和无病生存期(p<0.001)减少。第三部分miR-129-3p对肝细胞癌细胞生物学特性的影响方法:1.通过构建pri-miR-129-3p基因表达载体(pLMP/miR-129-3p)并稳定转染高侵袭性肝癌细胞(HCCLM3和MHCC97-H),以及合成miR-129-3p单链抑制物(anti-miR-129-3p)并瞬时转染低侵袭性肝癌细胞(HepG2和BEL-7402),人为改变细胞内miR-129-3p表达水平,运用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞体外迁移和侵袭能力的差异。2.收集可稳定过表达miR-129-3p的HCCLM3和MHCC97-H细胞(HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97H/miR-129-3p),建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组(HCCLM3/miR-NC或MHCC97-H/miR-NC)的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。3.运用Western blot和免疫荧光实验检测miR-129-3p表达改变后肝癌细胞中EMT分子标志物表达差异。结果:1.在HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97-H/miR-129-3p细胞中,细胞的体外迁移和侵袭能力与对照组(HCCLM3/miR-NC和MHCC97-H/miR-NC)相比明显下降(p<0.01)。相反,在HepG2和BEL-7402细胞中人为下调miR-129-3p表达水平,可促进细胞的体外迁移和侵袭能力(p<0.01)。2.由HCCLM3/miR-129-3p和MHCC97H/miR-129-3p细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内转移和肺转移结节的数目与对照组(HCCLM3/miR-NC或MHCC97-H/miR-NC)相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示细胞的体内转移能力受到抑制(p<0.001)。3.在HCCLM3和MHCC97-H细胞中人为上调miR-129-3p表达水平后,细胞中上皮标志物(E-cadherin和β-catenin)表达上升,间质标志物(N-cadherin和Vimentin)表达下降。相反,在HepG2和BEL-7402细胞中人为下调miR-129-3p表达水平后,细胞中上皮标志物(E-cadherin和β-catenin)表达下降,间质标志物(N-cadherin和Vimentin)表达上升。提示miR-]29-3p的表达可影响HCC细胞的EMT过程。第四部分miR-129-3p调控肝细胞癌细胞侵袭转移的分子机制研究方法:1.通过构建Aurora-A基因干扰质粒(pSil/shAurora-A)并稳定转染HCCLM3和MHCC97-H细胞,人为改变细胞内Aurora-A表达水平,运用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的差异;运用Western blot和免疫荧光实验检测细胞EMT分子标志物表达差异。2.收集可稳定干扰Aurora-A表达的HCCLM3和MHCC97-H细胞(HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A),建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组(HCCLM3/shcontrol或MHCC97-H/shcontrol)的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。3.合成Aurora-A基因真核表达载体(pMD-Auro),与空质粒对照(pMD-NC)分别转染HCCLM3/miR-129-3p细胞,Western blot技术检测Aurora-A表达水平的变化。划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的差异;Western blot和免疫荧光实验检测细胞EMT分子标志物表达差异。4.收集可稳定过表达 Aurora-A 的HCCLM3/miR-129-3p 细胞(HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro),建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型,10周后处死动物后取肝脏和肺脏组织,HE染色鉴定并比较其与对照组(HCCLM3/miR-129-3p/pMD-NC)的肝内转移和肺转移情况的差异;通过建立裸鼠原位肝癌移植瘤模型并饲养至所有荷瘤鼠死亡,比较其与对照组荷瘤鼠总生存时间的差异。5. Western blot 检测 HCCLM3/miR-129-3p 和 HCCLM3/miR-NC 细胞以及HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro细胞中 Aurora-A、磷酸化Akt (p-Akt),磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK), 总Akt和总p38 MAPK,以及MMP-2酶原 (pro-MMP-2)和活化MMP-2(active-MMP-2)的表达。用选择性p38 MAPK抑制剂(SB202190)或Akt抑制剂(LY294002)分别处理转染了anti-miR-129-3p的HepG2细胞,western blot检测磷酸化Akt(p-Akt),磷酸化p38 MAPK (p-p83 MAPK),总Akt和总p38 MAPK的表达。6.用选择性p38 MAPK抑制剂(SB202190)或/和Akt抑制剂(LY294002),单独或联合处理HCCLM3 和 MHCC97-H 细胞,以及转染了 anti-miR-129-3p 的 HepG2 和 BEL-7402细胞,再利用划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。7.用选择性p38 MAPK抑制剂(SB202190)和Akt抑制剂(LY294002)联合处理转染了anti-miR-129-3p的HepG2细胞,通过western blot检测细胞EMT分子标志物表达差异。结果1.与对照组相比,在HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A细胞中,细胞的体外迁移和侵袭能力明显下降(p<0.05);细胞中上皮分子标志物(E-cadherin和β-catenin)表达上升,间质分子标志物(N-cadherin和Vimentin)表达下降。提示阻断Aurora-A的表达可以模拟miR-129-3p对HCC细胞的体外生物学效应。2.由HCCLM3/shAurora-A和MHCC97-H/shAurora-A细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内转移和肺转移结节的数目与对照组(HCCLM3/shcontrol或MHCC97-H/shcontrol)相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示阻断Aurora-A表达可模拟miR-129-3p遏制细胞体内转移能力的作用(p<0.001)。3.在HCCLM3/miR-129-3p细胞中人为上调Aurora-A表达水平后,可以部分逆转miR-129-3p抑制Aurora-A表达、削弱细胞迁移侵袭能力以及诱导细胞中上皮分子标志物(E-cadherin和β-catenin)表达上升、间质分子标志物(N-cadherin和Vimentin)表达下降的作用。4.由HCCLM3/miR-129-3p/pMD-Auro细胞建立的裸鼠原位肝癌模型中,肝内转移和肺转移事件的发生率、肝内和肺转移结节的数目与对照组(HCCLM3/miR-129-3p/pMD-NC)相比均明显减少,裸鼠的总生存时间增加,提示Aurora-A可部分逆转miR-129-3p抑制细胞体内转移能力的作用(p<0.001)。5.在HCCLM3/miR-129-3p细胞中,Aurora-A表达下降,Akt、p38 MAPK信号通路活化水平降低,MMP-2活化和表达下降;外源性过表达Aurora-A可部分逆转miR-129-3p对Aurora-A、Akt、p38 MAPK信号通路活化和MMP-2表达的抑制作用;在HepG2细胞中,分别抑制PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路,可部分逆转anti-miR-129-3p所诱导的对PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路活化作用。提示miR-129-3p通过靶向Aurora-A调控Akt和p38 MAPK信号通路的活化以及MMP-2的活化和表达。6.在HCCLM3和MHCC97-H细胞中单独或同时抑制PI3K/Akt和p38 MAPK信号通路,可抑制细胞的迁移和侵袭能力;在HepG2和BEL-7402细胞中单独或联合抑制Akt和p38 MAPK信号通路,可部分逆转anti-miR-129-3p促进细胞迁移和侵袭的作用。提示miR-129-3p对HCC细胞侵袭转移的作用可能是通过调控PI3K/Akt和p38 MAPK两条信号通路来实现的。7.在HepG2细胞中同时抑制P13K/Akt和p38MAPK信号通路,可以部分逆转anti-miR-129-3p诱导的EMT过程,提示miR-129-3p抑制HCC细胞EMT的作用可能是通过调控PI3K/Akt和p38 MAPK两条信号通路来实现的。三、结论与意义1. 6个miRNA: miR-129-3p、miR-140-5p、miR-153-3p、miR-363-3p、miR-885-3p、miR-92a-3p能与Aurora-A基因mRNA 3’-UTR直接结合并参与了对Aurora-A基因表达的调控。2. miR-129-3p在肝细胞癌组织中呈低表达,并与Aurora-A的表达呈负相关。Aurora-A的表达与肝细胞癌患者淋巴结转移相关;miR-129-3p表达水平与肝细胞癌患者淋巴结转移、血行转移、TNM分期、肿瘤复发情况以及临床预后相关。3. MiR-129-3p可在体内、外抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和转移能力,逆转EMT过程。4.通过靶向抑制Aurora-A,调控p38 MAPK和PI3K/Akt信号通路的活化以及MMP-2的表达,可能是miR-129-3p影响肝癌细胞迁移、侵袭、转移和EMT过程的分子机制之一。5.本研究首次筛选和鉴定了靶向调控Aurora-A基因的miRNA分子,并以miR-129-3p为重点研究对象,分析了miR-129-3p在肝细胞癌中的表达以及其与临床病理特征和预后的关系,验证了miR-129-3p对肝癌细胞迁移、侵袭、转移和EMT过程等生物学过程的影响,并探讨了 miR-129-3p在肝细胞癌中发挥作用的分子机制。本实验从转录后水平揭示了肝细胞癌中Aurora-A基因表达紊乱的原因,为肝细胞癌侵袭转移的预防和治疗提供了新的分子靶点和治疗策略。