产磷酸甘油氧化酶菌种的筛选、鉴定及酶的分离纯化与性质研究

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磷酸甘油氧化酶(GPO,E.C.1.1.3.21)是用偶联酶法测定甘油三酯含量的关键酶之一,以其特有的高特异性和高灵敏度现已被广泛地应用到心脏病和高血脂的临床诊断中。 由于不同菌种所需的营养与培养条件不同,不同菌种来源的磷酸甘油氧化酶酶学性质和作用机理也不同,因此,本论文从产磷酸甘油氧化酶菌种的筛选及鉴定;Enterococcus sp.产磷酸甘油氧化酶的形成条件及该菌株扩大化培养的条件;酶的分离纯化及其基本性质四部分对Enterococcus SP.磷酸甘油氧化酶进行了研究。主要研究结果如下: 1.经过筛选,从23株菌株中选取B0502作为磷酸甘油氧化酶的生产菌种,其产酶活性达到0.231U/mL。该菌种经初步鉴定为Enterococcussp.。 2.以Enterococcus sP.作为研究对象,利用单因素和正交试验对Enterococcus SP.的发酵培养基及发酵条件进行了研究。优化的参数为:最优培养基组成(%):葡萄糖0.1,蛋白胨1.0,酵母提取物1.0,甘油0.4,K<,2>HP0<,4>0.5,盐溶液0.25mL,pH6.8。最适培养条件:250mL三角瓶中装100mL培养液,30℃、200r/min旋转摇床振荡培养18h。产酶活力比优化前提高了33.8倍。扩大化培养过程中,其他优化的条件不变,搅拌速度为100r/min,溶氧为6L/min时,培养周期较摇瓶培养缩短了6h,最大酶活力比摇床条件下酶活力提高了61%。 3.利用硫酸铵分级沉淀、DADE-Sepharose FF离子交换层析、PhenylSepharose CL-4B疏水层析、Chelating Sepharose F·F亲和层析和Sephacryl S-200HR层析分离纯化得到磷酸甘油氧化酶。该酶比活力达67U/mg,纯化倍数为117.5倍,回收率为18[%]。纯化后的磷酸甘油氧化酶经还原、非还原SDS—PAGE检测为单一蛋白染色带。非还原条件下SDS-PAGE测得其表观分子量为67.6kDa。 4.该酶最适pH为8.0,在pH4.5~8.0时37℃下存放1h,保留90[%]以上的酶活力;在pH9.0~9.5时37<。>C存放1h,残存酶活力仅为33[%]左右。最适反应温度为37℃。将酶液在20<。>C~35℃下处理15min,酶活力基本不变;在40<。>C处理15min,酶活力下降了39[%]。在最适条件下测得其米氏常数(Km)为32.2xlO<-3>mol/L。另外,研究了部分试剂对酶活的影响。Triton X-100、 EDTA、Fe<3+>对磷酸甘油氧化酶有激活作用,其中TritonX-100的激活作用尤其显著.Hg<2+>、SDS对磷酸甘油氧化酶有明显的抑制作用,Ba<2+>、Cu<2+>、 NaN<,3>对磷酸甘油氧化酶几乎没有影响。
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