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透明质酸酶可降解透明质酸,产生的寡聚糖与细胞外基质中不同类型的受体结合,在控制癌细胞侵袭、抑制血管再生等过程中发挥重要作用。目前制备的透明质酸酶存在干扰蛋白较多以及安全性等问题。牦牛睾丸透明质酸酶含量较高,是制备高活力透明质酸酶的良好原料。本文以牦牛睾丸为原料,旨在研究高纯度牦牛睾丸透明质酸酶的分离纯化方法,明确牦牛睾丸透明质酸酶的酶学性质,并利用HPLC、MALDI-TOF MS技术探究了牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸的机理。主要研究结果如下:1.确定了提取牦牛睾丸透明质酸酶的最佳工艺参数。牦牛睾丸透明质酸酶宜使用50 mM乙酸乙酸钠(pH 4.98)提取,最佳提取时间为33 h。提取液中添加NaCl(150 mmo L)、BSA(150 mM)、SAL(2.28 mM)可以降低酶活力损失。制备的粗酶液酶活力、比活力和产率分别为278 U、1.31 U/mg、1.06%。2.确定了纯化牦牛睾丸透明质酸酶的工艺参数。使用SP Sepharose Fast Flow可以有效去除粗酶液中的大部分污染蛋白。50 mM乙酸乙酸钠洗脱效果最好(包含1.0 M NaCl,pH 6.0),洗脱流速为5 mL/min。相较于线性洗脱(0~1 M NaCl),分步洗脱(0.05 M、0.1M、0.15 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M NaCl)分离效果更好。精细纯化使用Superdex75 PG来完成,50 mM乙酸乙酸钠(包含0.15 M NaCl,pH 6.0)洗脱效果最好,洗脱流速为0.5 mL/min。3.获得了高纯度牦牛睾丸透明质酸酶。SP Sepharose Fast Flow初步纯化粗酶液,获得的牦牛睾丸透明质酸酶比活力、纯化倍数、回收率分别为11.22 U/mg,8.56,65.76%。Superdex 75 PG精细纯化获得的牦牛睾丸透明质酸酶比活力、纯化倍数、回收率分别为42.27 U/mg,32.25,15.57%。精细纯化后的样品经RP-FPLC Shodex C4、SDS-PAGE检验纯度较高,分子量为55 kDa。4.明确了牦牛睾丸透明质酸酶的酶学特性。牦牛睾丸透明质酸酶水解透明质酸的最适温度为37℃,Km值为0.102 mg/mL。该酶适宜低温保存,4°C条件下酶活力相对较高。Fe3+、Mg2+、肝素对牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸具有明显抑制作用。牦牛睾丸透明质酸酶水解透明质酸的能力最强,水解Chondroitin-4-sulphate、Chondroitin-6-sulphate、皮肤素的能力相对较差。采用Morgan–Elson法和浊度法测得的最适pH分别为3.8、5.8。5.发现酸性条件下,牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸只生成偶数透明质酸寡聚糖。酸性条件下(pH 3.8),牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸3 h得到的水解产物为还原末端含有N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)的偶数透明质酸寡聚糖,典型产物是透明质酸四糖(776.5 Da)、己糖(1155.6 Da)、八糖(1534.7 Da)、十糖(1913.8 Da)、十二糖(2293.4 Da)。延长降解时间至24 h,透明质酸四糖和己糖浓度升高,八糖、十糖和十二糖浓度降低。6.发现弱酸性条件下,牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸同时生成奇数、偶数透明质酸寡聚糖。弱酸性条件下(pH 5.8),牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸3 h得到的水解产物为5种偶数透明质酸寡聚糖和3种还原末端含有葡萄糖醛酸的奇数透明质酸寡聚糖。奇数寡聚糖分别是透明质酸三糖(573.4)、戊糖(952.5 Da)和七糖(1331.6 Da)。延长降解时间至24 h,透明质酸三糖和戊糖的浓度明显升高。7.牦牛睾丸透明质酸酶对偶数透明质酸寡聚糖具有降解作用。酸性条件下(pH 3.8),牦牛睾丸透明质酸酶不仅降解透明质酸,还会进一步降解透明质酸的水解产物?偶数透明质酸寡聚糖,最小降解单元为八糖。这是导致牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸的时间由3 h延长至24 h时,四糖和己糖浓度升高的主要原因。8.阐明了牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸的两种不同途径。一种途径为:酸性条件下(pH 3.8),牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸生成还原末端为NAG的偶数透明质酸寡聚糖。随着降解时间的延长,牦牛睾丸透明质酸酶又以透明质酸八糖为最小单元降解偶数透明质酸寡聚糖,生成四糖和己糖,使水解产物中的四糖和己糖浓度升高,八糖、十糖、十二糖浓度降低;另一种途径为:弱酸性条件下(pH 5.8),牦牛睾丸透明质酸酶降解透明质酸生成还原末端为NAG的偶数透明质酸寡聚糖和还原末端为葡萄糖醛酸的奇数透明质酸寡聚糖,并且分子量相对较大的奇数透明质酸寡聚糖浓度随降解时间的延长而逐渐降低,三糖和戊糖的浓度明显升高,这是导致最适pH为5.8的根本原因。奇数寡聚糖的形成与终止酶反应无关,也不是由偶数透明质酸寡聚糖分解产生的。综上可知,牦牛睾丸是制备透明质酸酶的可靠原料,通过分离纯化获得了高纯度牦牛睾丸透明质酸酶,并明确了该酶的酶学特性。阐明了牦牛睾丸透明质酸酶在不同酸性条件下降解透明质酸的途径。这对深入探究不同类型透明质酸寡聚糖在细胞外基质中的作用机制具有重要参考价值。