由于草浆等纸浆存在滤水性差、强度低等缺点,使其应用受到限制,一般生产过程中需要对其进行改性以改善滤水和强度性能。与化学法改性相比,采用纤维素酶(主要是内切酶EG)处理对纸浆改性是一种环境友好的技术,且已被证明在改善纸浆滤水性,提高成纸强度等方面具有良好效果。由于制浆造纸工艺往往在中、碱性条件下进行,这就要求使用的酶能够在高pH条件下维持酶活性,保证其催化作用有效进行。但市场上已有的商品纤维素酶大多为酸性酶,在碱性条件下酶活很低。虽然国内外对碱性纤维素酶的研究正逐渐深入,但目前仍存在很多问题,例如,已有产碱性纤维素酶菌株的产量低、酶系不合理、酶改性机理尚未完全清楚等。因此,设法提高碱性纤维素酶产量,合理优化酶系,以降低纤维素酶生产成本和提高对纸浆的改性效果,同时深入研究酶法改性机制等,对促进酶在造纸工业中的应用,降低生产成本等具有重要意义。基于以上背景,本论文在实验室前期研究基础上,通过构建耐碱性纤维素酶菌株,以希望提高纤维素酶产量;同时通过构建耐碱性纤维素酶与木聚糖酶共表达菌株,以达到优化改性酶系、提高酶法改性效果的目的;同时从不同角度研究了纸浆酶法改性的机制。本论文主要研究内容和结果如下:1.耐碱性纤维素酶的表达及其对纸浆改性效果研究为获得适合纸浆改性用的耐碱性纤维素酶,在实验室前期研究基础上,扩增来源于特异腐质霉的三个耐碱性内切纤维素酶H.EGⅠ,H.EGⅡ,H.EGⅤ的基因,并在毕赤酵母GS115中成功异源表达;同时在大肠杆菌BL21中成功异源表达了来源于不同芽孢杆菌的三个内切纤维素酶Y106-EG,z-16-EG及A30-EG。测定纯化后重组耐碱性纤维素酶的性质,发现这六种内切纤维素酶的最适pH在6.5-7.5左右,最适温度在50℃-60℃之间,各酶在pH 6.0-8.0条件下放置1h能够维持60%以上酶活性,其中Y106-EG、z-16-EG和H.EGV在pH 9.0条件下放置1 h可以维持60%以上酶活性。将六种耐碱性内切酶应用于麦草浆改性,发现Y106-EG在酶用量仅为0.2 IU/g条件下,与对照相比,能够降低12.5%的打浆度,抗张强度指数,耐破指数,撕裂指数分别提升14.6%、14.3%和10.7%。对纸浆的改性效果明显优于其它五种耐碱性内切葡聚糖酶,显示出良好的潜在应用前景。2.重组菌Y106OE-EG粗酶液对不同纸浆改性时的酶处理条件优化及与其它酶的协同作用研究为提高耐碱性纤维素酶Y106-EG的产量,利用基因工程方法,实现Y106-eg基因的同源过表达,经实验室前期优化的发酵培养基发酵,所得发酵液的CMCase酶活达到8.45 IU/ml,是出发菌株的8.28倍。利用工程菌Y106OE-EG粗酶液对杨木CMP(杨木化学机械浆),松木CMP(松木化学机械浆),麦草CP(麦草化学浆)进行改性研究发现,改性效果依次为麦草CP>杨木CMP>松木CMP。对酶法改性时的酶处理条件(处理温度、时间和pH等)进行了优化,发现当酶用量仅为0.2 IU/g浆,pH 7.0,温度55 ℃条件下对麦草浆处理2 h,与未用酶处理的对照相比,纸浆的抗张指数,耐破指数,撕裂指数分别增加了15.4%、16.9%和 11.8%。研究了工程菌Y106OE-EG粗酶液与其它酶的协同改性效果,发现Y106OE-EG的内切纤维素酶与纤维素膨胀因子SWO4的联合处理,与单独使用内切酶或SWO4相比,反而降低了纸浆的强度和纤维素结晶度,而当与β-葡萄糖苷酶(1.2 IU/g)或木聚糖酶(5IU/g)联合处理时,对纸浆的强度性质(抗张指数,撕裂指数,耐破指数)均有明显改善,在温度55 ℃C、pH 7.0条件下处理2 h,当Y106OE-EG粗酶液用量为0.2IU/g,也β-葡萄糖苷酶1.2IU/g时,与对照相比,麦草浆的抗张指数、撕裂指数、耐破指数分别提升23.68%、34.10%、20.82%。当木聚糖酶加量为5 IU/g时,与对照相比,麦草浆的抗张指数、撕裂指数、耐破指数分别提升32.65%、42.44%、25.00%。此外,木聚糖酶与SWO4或木糖苷酶的联合处理,对麦草浆的改性也具有良好的协同作用效果。综合而言,Y106OE-EG生产的内切纤维素酶与短小芽孢杆菌生产的木聚糖酶Xyn30的协同处理对纸浆的改性效果最佳,为后续的共表达菌株构建提供了理论依据。3.产耐碱性纤维素酶与木聚糖酶共表达菌株构建及产酶条件优化为实现耐碱性纤维素酶(Y106-EG)及木聚糖酶(Xyn30)在Y106-WT中的共表达,采用顺反子共表达,融合酶表达,串联共表达三种方式,意在提高枯草芽孢杆菌Y106-WT的产酶能力,结果表明,以串联共表达的方式能够实现两酶的共表达,对构建的共表达工程菌Y106OE-EG-Xyl进行液体发酵,发现该菌株在培养56 h后,CMCase酶活可达最高(8.20 IU/ml),木聚糖酶在菌株培养64 h时酶活达到最高(60.40 IU/ml),分析该菌株产粗酶液的酶系发现,其滤纸酶活(0.12IU/ml),外切纤维素酶活性(0.02IU/ml),β-葡萄糖苷酶(未测到)均较低,说明对应用于纸浆改性而言,共表达菌所产纤维素酶的酶系比较合理,在对纸浆进行改性的同时不损害纸浆纤维。利用工程菌Y106OE-EG-Xyl粗酶液在最佳处理pH 7.0,最佳处理温度55 ℃C,浆浓度10%(w/v)条件下处理麦草化学浆2 h,当酶用量为纤维素酶0.2 IU/g木聚糖酶活1.5IU/g时,与对照及单独添加纤维素酶(0.2IU/g)及木聚糖酶(1.5 IU/g)相比,纸浆白度和强度性能都有改善,其中与不加酶的对照浆处理相比,纸浆白度增加2.0%ISO,抗张指数、耐破指数、撕裂指数分别增加8.7%、16.6%和9.3%,而打浆度降低了 15%。利用混料设计优化了工程菌Y106OE-EG-Xyl发酵时培养基中的碳源及诱导剂比例,发现当麸皮,玉米芯,乳糖配比为3.33%、0.83%、0.83%时,液体发酵72 h,纤维素酶活可达7.9 IU/ml,木聚糖酶活可达74.5 IU/ml,木聚糖酶活比优化前提升了 14.1个酶活单位,且木聚糖酶与内切纤维素酶的比由原来的7.5提升至 9.4。4.纸浆的酶法改性机制研究通过对Y106OE-EG粗酶液处理前后纤维质量变化,纤维结晶度(XRD)及红外光谱(FITR-ATR)等的变化分析发现,经重组菌Y106OE-EG粗酶液处理后,杨木CMP和麦草CP的纤维质量得到明显改善,且改善效果好于松木CMP。Y106OE-EG粗酶液处理后,杨木CMP及麦草化学浆的结晶度与对照相比明显提高,但松木CMP结晶度则提高不明显,三种浆经酶处理后纸浆中的氢键强度均有所提升。分别提取了麦草CP、松木CMP和杨木CMP中的木质素组分,研究了木质素对Y106OE-EG的酶蛋白吸附特征,发现松木CMP和杨木CMP的木质素对纤维素酶蛋白的吸附能力明显高于麦草浆中的木质素,木质素对蛋白的不可逆吸附将影响酶对纤维底物的作用,因此相对而言,Y106OE-EG酶液更适合用于麦草浆的改性。分别利用Y106OE-EG和Y106OE-Xyl及共表达菌株Y106OE-EG-Xyl的粗酶液(EG 0.2 IU/g、Xylanase 1.5 IU/g、EG 0.2 IU/g-Xylanase 1.5 IU/g)处理纸浆,发现与对照或只添加EG或木聚糖酶的样品相比,共表达菌株的粗酶液处理后纸浆纤维的平均长度增加,宽度几乎不变,长宽比变大,细小纤维含量减少,卷曲指数及扭结指数均有所降低,且共表达菌株的粗酶液处理效果优于单独酶的处理效果。利用红外谱图对共表达菌株Y106OE-EG-Xyl粗酶液处理前后草浆的吸收峰相对强度进行分析,发现经共表达菌株粗酶液处理后,氢键强度明显提升。利用SEM观察了重组菌Y106OE-EG及共表达菌株Y106OE-EG-Xyl的粗酶液处理前后草浆纤维表面形态变化,发现经两菌株的粗酶液处理后,与对照相比,纸浆中的细小纤维含量明显减少,纤维变得平整。酶处理后纸浆在纤维质量、纤维素结晶度、氢键强度、表面形态等方面发生的上述变化,是酶处理改善纸浆强度和滤水性能的内在原因。分别从酶的结构和性质、蛋白表面电荷、蛋白的疏水性、蛋白在纸浆纤维上的吸附等角度,探讨了 Y106-EG所产粗酶液与来源于特异腐质霉的三个耐碱性内切纤维素酶H.EGⅠ、H.EGⅡ和H.EGⅤ以及来源于其它芽孢杆菌的两个耐碱性内切纤维素酶z-16-EG和A30-EG对麦草浆的改性差异及内在原因。研究发现,与其它五种耐碱性内切纤维素酶相比,Y106-EG由于酶蛋白对底物的亲和力相对较大,且在pH 7.0时,pH值低于其自身等电点使其氨基酸易被带上正电荷,另外,蛋白表面的Zeta电位与其它几种耐碱性内切酶相比负值较小,且蛋白的疏水性小,这些都使得Y106-EG酶蛋白更易于与带负电荷的细小纤维发生亲水性结合,从而有利于酶降解细小纤维。此外,Y106-EG酶蛋白是典型的(β/α)8桶状结构特征,结构稳定性较好且开口宽阔的活性中心使其可以容纳更多类型不同的多糖支链,在催化降解复杂底物时有较大优势,该酶的CBM属于A型CBM,易于结合于结晶型纤维素多糖上。这些特征使得Y106-EG在用于纸浆改性时表现出较好的优势。