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第一章十两茶提取物抑制高血脂诱导的血管内皮功能障碍及动脉粥样硬化形成研究背景动脉粥样硬化（AS）导致的心脑血管疾病是严重危害人类健康和死亡的一大类疾病。血管内皮功能障碍是AS血管早期的一个重要病变特征,也是AS发生的始动环节。高脂血症被认为是AS的独立危险因素之一。大量动物实验和临床研究显示,高脂血症动物和患者均伴有血管内皮功能不全;血中低密度脂蛋白（LDL）的浓度提升及氧化增加是高脂血症诱导内皮损伤的关键原因。因此,降脂和保护内皮功能被认为是防止高脂血症发展为AS的关键手段。L-精氨酸的同类物非对称二甲基精氨酸（ADMA）是一种内源性一氧化氮合酶（NOS）抑制物,能竞争性抑制NOS活性,减少一氧化氮（NO）生成。在高脂血症动物模型和临床患者血管内皮功能障碍与血浆ADMA水平显著升高密切相关;在体外培养的内皮细胞,ADMA能损伤血管结构、诱导氧化应激、促进血管炎症和脂质摄取。此外,在多种动物模型,外源性ADMA能直接诱导动脉粥样斑块形成。因此,ADMA能损伤血管内皮功能,是一个新的“内源性致AS分子”。茶叶是我国的主要饮品,含有多种多酚类化合物如儿茶素和茶多酚,具有抗氧化,调血脂和抗AS等功效。黑茶如花卷、茯茶为湖南茶叶的主要品种,花卷茶系紧压茶,产于湖南安化一带。关于湖南黑茶的心血管保护作用及机制的研究尚不多见。本实验在两种不同的高脂血症动物模型,观察花卷茶之十两茶提取物对血脂、血管内皮功能和AS形成的影响并进一步探讨其作用是否与调节ADMAA/NO系统有关。本章分为两节:①十两茶提取物对高胆固醇血症大鼠血脂和内皮功能的影响;②十两茶提取物对高脂诱导家兔动脉粥样硬化形成的影响。第一节十两茶提取物对高胆固醇血症大鼠血脂和内皮功能的影响方法雄性SD大鼠高脂饲养4周诱发高胆固醇血症,其中实验组在高脂饲料饲养2周后开始每日灌胃给予不同剂量的十两茶水提物（50、100和200 mg/kg）,持续2周。实验结束后,颈动脉取血测定血脂、NO、ADMA和丙二醛（MDA）含量;分离胸主动脉检测血管内皮依赖性舒张功能。结果十两茶提取物能呈剂量依赖性地降低高脂血症大鼠血清总胆固醇和LDL及甘油三酯水平。十两茶提取物能显著改善高脂所诱导的血管内皮舒张功能障碍,降低血浆ADMA和MDA含量以及增加NO水平,且呈剂量依赖性。结论十两茶提取物具有降低血脂和保护血管内皮功能作用,其作用与抑制脂质过氧化、调节ADMA/NO系统有关。第二节十两茶提取物对高脂诱导家免动脉粥样硬化形成的影响方法家兔高脂饲料喂养4周后,分别灌胃给予不同剂量的十两茶提取物（25、50和100 mg/kg）,共4周。实验结束后,颈动脉取血检测红细胞变形能力,测定血脂、NO、ADMA和MDA含量;分离胸主动脉检测脂质斑块面积和血管内皮依赖性舒张功能。结果十两茶提取物能呈剂量依赖性降低高脂饲养家兔血清总胆固醇和低密度脂蛋白水平,同时显著减少主动脉粥样斑块面积和改善血管内皮舒张功能及红细胞变形能力。十两茶提取物显著降低血清MDA和ADMA含量和增加NO水平,且呈剂量依赖性。结论十两茶提取物具有抗动脉粥样硬化作用,其机制与抑制脂质过氧化、调节ADMA/NO系统,改善血管内皮功能和红细胞变形能力有关。第二章十两茶提取物抑制ox-LDL所致血管内皮细胞及内皮祖细胞功能障碍及机制研究研究背景血管内皮功能不全与内皮细胞的衰老及功能紊乱密切相关。氧化应激被认为是导致细胞衰老的关键因素。LDL增加被认为是高脂血症引起血管内皮功能不全的主要原因。研究证明,LDL能够在内皮聚集和氧化及诱导血管内皮细胞衰老加速,进而损伤内皮依赖性舒张反应。由于成熟的内皮细胞为终末分化细胞,其受损后自我增生、分化、修复能力有限,因此如何保护内皮功能和加速受损内皮的修复对于AS早期的防治有重要意义。新近研究发现,骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）能分化为成熟的内皮细胞,能促进血管再内皮化,参与了血管内皮的损伤后修复。在心血管高危人群中AS的发生发展与循环EPCs的数量和功能降低,内皮损伤后不能得到有效修复有关。如第一章所述,内源性NOS抑制物非对称二甲基精氨酸（ADMA）能损伤血管内皮功能和促进AS形成。体内ADMA水平主要由其特异性水解酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶（DDAH）的活性调节。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育内皮细胞能显著降低DDAH活性和增加ADMA水平,而改善DDAH活性能显著抑制其诱导的细胞损伤。近期研究发现,DDAH/ADMA也能通过NO和血管内皮生长因子（VEGF）调节EPCs功能。研究显示,冠心病患者血浆ADMA水平与循环中EPCs数目成反比,且外源性ADMA能浓度依赖性抑制EPCs的增殖。在第一章的研究中,我们发现十两茶提取物能显著降低血浆ADMA水平和改善高脂血症大鼠和家兔主动脉内皮功能,提示其内皮保护作用与调节DDAH/ADMA途径有关。为进一步阐明其血管保护作用的细胞分子机制,我们观察了十两茶提取物对ox-LDL诱导的内皮细胞衰老和EPCs功能障碍的影响。本章分为两节:①十两茶提取物对ox-LDL致内皮细胞衰老的影响;②十两茶提取物对ox-LDL致EPCs功能障碍的影响。第一节十两茶提取物抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞衰老的影响方法1.培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）;分离提取人LDL,Cu2+诱导其氧化;2.检测β—半乳糖苷酶活性（染色法）和端粒酶活性（TRAP—银染法）评价细胞衰老状态;3.使用荧光染料H2DCF检测细胞内氧自由基生成;4.高效液相色谱（HLPC）检测培养液ADMA水平及细胞内DDAH活性;5.Real time PCR检测DDAH2 mRNA水平;6.设计DDAH siRNA,脂质体介导转染入HUVECs沉默DDAH2基因表达。结果1.ox-LDL（100μg/ml）处理48 h后,β—半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著增加,而端粒酶活性显著降低,与正常组比较具有统计学差异（P＜0.01）。预先给予不同浓度的十两茶提取物（1、2.5和5 mg/ml）可显著抑制ox-LDL诱导的β—半乳糖苷酶染色阳性细胞数增加和端粒酶活性降低。2.ox-LDL（100μg/ml）孵育HUVECs 48 h,可明显增强细胞内活性氧族（ROS）水平。然而,预处理不同浓度的十两茶提取物（1、2.5和5 mg/ml）能显著抑制ox-LDL诱导的ROS水平增加。3.ox-LDL（100μg/ml）孵育HUVECs 48 h,可显著增加培养液中ADMA水平和降低细胞内DDAH活性。然而,预处理不同浓度的十两茶提取物（1、2.5和5 mg/ml）能显著抑制ox-LDL诱导的ADMA水平增加和DDAH活性的降低。这样的处理均不影响DDAH2 mRNA的表达。4.DDAH2 siRNA能明显抑制十两茶提取物（5mg/ml）抗ox-LDL诱导的β—半乳糖苷酶阳性细胞数增加和端粒酶活性下降作用。结论十两茶提取物抑制ox-LDL诱导的内皮细胞衰老,其作用可能与抑制氧化应激,改善DDAH活性和降低ADMA水平有关。第二节十两茶提取物抑制ox-LDL致内皮祖细胞功能障碍的影响方法1.培养和鉴定人脐静脉血EPCs;2.检测细胞迁移能力和Tube形成能力评价EPCs功能;3.HLPC检测培养液ADMA水平;酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养液VEGF水平;结果1.ox-LDL（100μg/ml）处理48 h后,EPCs迁移和Tube形成能力均显著下降,与正常组比较具有统计学差异（P＜0.01）。预先给予不同浓度的十两茶提取物（1、2.5和5 mg/ml）可显著抑制ox-LDL诱导的EPCs迁移和Tube形成能力降低。2.ox-LDL（100μg/ml）孵育EPCs 48h,可明显增加培养液中ADMA水平和降低VEGF水平。预处理不同浓度的十两茶提取物（1、2.5和5 mg/ml）能显著抑制ox-LDL诱导的ADMA水平增加和VEGF水平的降低。结论十两茶提取物抑制ox-LDL诱导的EPCs功能障碍,其作用可能与抑制氧化应激,降低ADMA水平和增加VEGF生成有关。