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小儿腹泻疾病(pedo-diarrheal disease)是由多病原、多因素引起的以大便次数增多和大便性状改变为特点的消化道疾病,是导致全球5岁以下儿童死亡的第二大原因。其病因复杂,治疗较困难,易造成营养不良等疾病,严重影响婴幼儿的生长发育,甚至引起死亡,是发展中国家小儿死亡的主要原因之一,故WHO把腹泻病的控制列为全球性战略。病毒性腹泻是是小儿腹泻的主要类型,引起小儿腹泻的主要病原体有：人轮状病毒(human rotavirus, HRV)、人诺如病毒(human norovirus, HNV)人星状病毒(human astro virus, HAstV)、肠道病毒(entero virus, ET virus)、甲肝病毒(hepatovirus)等,其中最常见的是HRV. HNV和HAstV。本研究主要针对昆明市小儿腹泻有关病毒HRV、 HNV和HAstV进行分子流行病学研究；利用逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增得到部分HNV全基因组cDNA和全部HAstV全基因组序列；另外,以人结肠癌细胞(HT-29cell)为基质,对HT-29细胞分离培养HAstV的相关条件进行了初步探索。(1)昆明地区HRV、 HNV和HAstV流行病学研究和病毒分型根据基因库中HRV、 HNV和HAstV各病毒的核苷酸特异性高度保守区设计病毒鉴定引物和病毒分型引物。通过对RT-PCR检测体系及条件的摸索,建立起稳定的HRV、 HNV和HAstV三种病毒检测体系。对39份小儿腹泻粪便检测结果为：HRV13份、HNV12份和HAstV12份,占总量百分比分别为的33.33%、30.77%、30.77%。通过RT-PCR和分型序列测序方法对病毒分型,HNV全为GⅡ型；HAstV全为HAstV-1型；HRV型别有：2例?P[6]、1例?P[9]、1例?P[10]、1例?P[8]、1例G2P[8]、4例G2P[4]、1例?P[4]和?P[8]混合感染样品、1例G2P[8]和G8P[8]混合感染样品,其中G2P[4]型所占比列最高33.3%,可能为昆明地区HRV的优势流行株。(2)克隆HNV和HAstV病毒基因组cDNA从NCBI GeneBank中下载各型别HNV和HAstV病毒全基因组,用DNAMAN软件比对后,根据比对结果设计病毒基因组扩增引物各6对。RT-PCR对HNV和HAstV基因组扩增结果为：3段HNV全基因组共计3.6kb；全长HAstV基因组6.8kb,上传至GENEBANK登录号为KC342249,并命名为KM-l。 HAstV全基因组核苷酸序列与同型别病毒株SH-1同源性为98.4%,印度株(G1)95.0%；与其它型别病毒同源性分别为：G282.9%,G381.9%,G476.2%,G582%,G666.2%, G884.5%。 KM-1全基因组氨基酸同源性比较,发现KM-1的ORFla, ORFlb编码的非结构蛋白前体和RNA依赖的RNA酶与其它型别的病毒株同源性较高,而KM-1ORF2编码的衣壳蛋白前体氨基酸与同型别病毒同源性较高,印度株为97.97%,上海株(SH-1)为98.35%；与不同型别的HAstV在该区段的同源性较低,在62.64%-75.79%之间。重组事件分析发现KM-1有3个序列区域发生重组,分别是1996-2229碱基区、3608-4155碱基区和3608-4155区域。1996-2229区域与俄罗斯株(GU732187)同源性最高：3608-4155区域与韩国株(JN887820)同源性较高,5937-5981区域可能来源于印度株(AF260508)。(3) HAstV的培养以初培养密度为40%-50%的HT-29细胞为基质,将病毒稀释液处理后的HAstV腹泻粪便上清1ml接种到HT-29细胞上,并加入胰蛋白酶致终浓度10ug/mL,用含2%小牛血清的维持液培养,第3、6d后分别收取细胞和上清,RT-PCR鉴定结果表明HAstV能够被HT-29细胞从粪便样品中分离出来。PEG或超滤法浓缩病毒后电镜镜检观察到HAstV,直径为40nm左右。本实验较为详细的对2012-2013年昆明地区小儿腹泻有关病毒分子流行病学调查并准确地进行了病毒分型,以上数据连同扩增得到的HNV、 HAstV基因组以及HAstV的成功培养,为进一步研究HRV、 HNV、 HAstV打下了坚实的基础。