研究背景和目的冠心病严重危害人类健康，我国冠心病死亡人数占人口总死亡数的15％以上。心肌缺血后有效的血运重建对保护心功能、改善患者远期预后起关键作用。整合素是细胞表面重要的黏附分子，介导细胞与细胞外基质相互作用，在细胞增殖、分化及细胞移行等一系列生物活动中起重要作用。四跨膜超家族（TM4SF）是是整合素的关联蛋白。细胞外信号向细胞内信号转导大多通过integrin-Tetraspanin-PKC复合体这一模式。CD151能与多种整合素亚型结合形成复合体，是整合素信号转导的跨膜连接器，在细胞迁移、粘附以及体外血管形成中均发挥着重要的作用。我们课题组近几年来在国际上首次开展了多项有关CD151促血管生成的研究：①应用Matrigel模型观察到CD151在维持细胞形态及体外血管形成中的作用，发现在抗CD151抗体和抗α6β1抗体的分别干预下，血管内皮细胞在Matrigel上的网格状结构形成能力明显受到抑制；②CDl51重组腺相关病毒转染脐静脉内皮细胞，能使细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力明显增强；③转染CD151的大鼠缺血后肢肢体功能、微血管增生及侧支循环形成能力均明显强于未转染CD151的大鼠；④在大鼠心肌梗死模型中导入CD151重组腺相关病毒，缺血心肌局部毛细血管密度明显增加，血流动力学的各项指标左室收缩压峰值（LVPSP）及左室内压最大上升和下降速率（±dp／dtmax）均有明显提高。前期研究告诉我们CD151可以改善小动物模型（大鼠心肌梗死）心肌血供和心脏功能，那么在大动物模型CD151是否同样起到改善心肌血供和心脏功能的作用呢?另有研究发现心脏功能的改善需要心肌细胞绝对数目的保存，心肌梗死后期非梗死区持续发生心肌细胞凋亡是导致心功能恶化的主要原因，跨膜4超家族成员CD53以及CD9已被证实在细胞凋亡中起重要作用，那么CD151是否有抑制心肌细胞凋亡的作用，从而改善心脏功能呢?本实验中，我们构建CD151重组腺相关病毒，转染小型猪心肌梗死模型，使CD151在小型猪缺血心肌组织及非梗死区心肌组织表达上调，观察CD151的表达对小型猪心肌梗死后心肌梗死面积、缺血心肌血流灌注、心功能及非梗死区心肌细胞凋亡的影响及其可能机制，为冠心病的治疗探索新途径。研究方法构建pAAV-GFP、pAAV-CD151、pAAV-antiCD151质粒。扩增、提取、纯化质粒，采用三质粒钙磷共转染法包装重组腺相关病毒。心肌梗死模型制备、实验分组及重组腺相关病毒的心肌转染。小型猪22头（1月龄），随机分为4组：①正常对照（Control）组（4头）：冠状动脉不予结扎。②GFP组（6头）：结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射rAAV-GFP，总量为1×10¹²pfu。③CD151组（6头）：结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射rAAV-CD151，总量为1×10¹²pfu。④antiCD151组（6头）：结扎冠状动脉左前降支，心肌内分10点注射rAAV-antiCD151，总量为1×10¹²pfu。病毒转染8周后进行如下几个方面的研究：（1）RT-PCR检测外源基因导入情况；（2）蛋白免疫印迹（Western blot）检测心肌中CD151的表达水平，评价rAAV-CD151在心肌中的转染效果；（3）冠状动脉造影评价冠脉侧支循环的建立；（4）¹³N-NH₃ PET／CT显像评价心肌血流灌注，并计算梗死面积；（5）超声心动图进行心脏射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）及室壁厚度的测定，评价心功能；（6）TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，评价CD151对心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响；（7）PCR方法检测凋亡相关基因的表达，Western blot免疫印迹检测心肌中bcl-2、bax蛋白的表达，探讨CD151对凋亡影响的可能机制。实验结果（1）成功建立小型猪心肌梗死模型。冠脉造影示冠状动脉左前降支第二对角支远端完全闭塞；术后8周病理切片示梗死心肌为大量结构紊乱纤维组织取代；（2）RT-PCRCD151组心肌组织检测到外源性CD151mRNA的表达，Control组、GFP组、antiCD151组未检测到外源性CD151 mRNA的表达；Western blot检测四组CD151的表达水平，CD151与参照条带相对吸光度值依次为：1.33±0.19、1.11±0.10、2.38±0.12和0.73±0.21，表明心肌直接注射rAAV-CD151可使心肌中CD151蛋白质表达明显增加（P＜0.05）；（3）冠脉造影显示心肌梗死后第8周，GFP组可有少量的侧支血管，CD151组侧支血管水平评定0～3级都有，antiCD151组几乎无侧支血管形成；（4）¹³N-NH₃ PET心肌灌注提示，术后第8周心肌血流灌注CD151组较GFP组显著改善，缺损面积明显减少（P＜0.05）；antiCD151组缺损面积增加，缺血更严重（P＜0.05）。术后8周缺损面积占整个显像面积的百分比，GFP组、CD151组、antiCD151组缺损面积百分比依次为（21.13±3.6）％，（13.34±3.3）％和（29.45±5.7）％；（5）超声心动图提示，反映心肌收缩功能的指标：EF、FS、△T、△IVST，CD151组均显著高于GFP组（P＜0.05），而低于Control组（P＜0.05），超声指标：EF、FS、△T、△IVST、ALWTd、IVSTd antiCD151组均较CD151组低（P＜0.05），超声指标：ALWTd、IVSTd，CD151组较正常对照组增加，但差异无统计学意义；（6）TUNEL染色结果表明CD151组凋亡指数明显少于GFP组及antiCD151组（P＜0.05）；CD151组凋亡指数与对照组差别无显著性差异（P＞0.05）。Control、GFP、CD151、antiCD151组凋亡指数分别为（1.83±0.98）％、（14.05±0.17）％、（2.21±0.35）％及（18.20±0.73）％；（7）PCR结果提示：CD15l组Bax／Bcl-2 mRNA（0.41±0.06）较GFP组（2.33±0.03）及antiCD151组（4.01±0.02）明显降低（P＜0.05），与Control组（0.38±0.02）比较差异无统计学意义（P＞0.05），Western blot免疫印迹检测Control、GFP、CD151、antiCD151四组bax、bcl-2的表达水平，bax／bcl-2依次为：0.93±0.04、3.21±0.12、1.13±0.11和3.53±0.09，CD151组bax／bcl-2较GFP组及antiCD151组明显降低（P＜0.05）。实验结论1、小型猪心肌直接注射rAAV-CD151可明显上调心肌中CD151的表达。2、CD151表达的上调可明显促进心肌梗死后小型猪心脏血管生成，改善血流灌注，减小心肌梗死面积。3、CD151的高表达可改善心肌细胞凋亡，改善小型猪梗死后心功能，其机制与CD151促进新生血管形成以及CD151对Bax、Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达相关。