炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),是一种病因和发病机制至今尚不十分清楚的非特异性肠道疾病,具有慢性及反复发作的特点。肠纤维化是IBD较严重的并发症,被认为是肠道组织对于慢性炎症和损伤过度的、不可逆的伤口愈合反应。有数据表明,40%以上的CD有程度不等的肠梗阻,约80%的患者最终需要手术治疗。可见,肠纤维化已成为临床IBD治疗中面临的重要问题。CD4~+T细胞是免疫系统中最重要的免疫调节细胞,在调控体内免疫应答和维持免疫平衡稳定中发挥重要作用。其辅助性T细胞(T helper cell,Th)又包含Th1、Th2及Th17三种细胞亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等促炎介质来调节细胞免疫反应;而Th17细胞主要分泌IL-17和IL-6等细胞因子。目前倾向于Th1和Th17细胞主要参与CD发生。肠纤维化的发生是一种复杂、动态的病理生理过程,目前认为是在易感基因基础上,出现肠黏膜免疫失调,与肠菌抗原相互作用,产生炎症细胞浸润,释放的炎症因子和生长因子等激活肠道间质细胞进而产生胶原等细胞外间质(extracellular matrix,ECM)成分沉积于肠壁所致[1]。在肠道纤维化过程中主要的效应细胞是肠道成纤维细胞(intestinal fibroblasts,IFBs),当该细胞增殖及活化增强时,其增殖与活化的标志物Vimentin和α-SMA表达上调。IFBs的合成与分泌ECM的功能增强,一般情况下,成纤维细胞不表达α-SMA蛋白,但在各种因素如细胞因子和炎症因子等的刺激下将发生活化,其α-SMA与胶原合成的功能均增强。TGF-β/Smads信号传导对于肠成纤维细胞活化以及其所产生的效应改变发挥着不可忽视的作用。研究显示,肠道炎症发生过程中I型胶原、III型胶原沉积和TGF-β1表达增加的同时,磷酸化Smad3表达也增加。肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A,TL1A)在炎症组织巨噬细胞、黏膜固有层T淋巴细胞、单核细胞和DC中均有表达。TL1A作为TNF的唯一配体,可通过与其受体肿瘤坏死因子受体超家族成员死亡受体3(death receptor 3,DR3)结合,为T淋巴细胞的激活提供协同刺激信号,促进Th1和Th17细胞的极化及效应功能,在机体免疫调节中发挥重要作用。TL1A可通过与IL-12/IL-18结合而增强IFN-γ的诱导表达,其持续表达可促进黏膜的炎性反应和肠壁纤维化的发生、诱导纤维性狭窄的发生。TL1A不仅可单独或协同IL-12和IL-23作用于Th1细胞分泌IFN-γ,同时还可作用于Th17细胞使其分泌IL-17增加。TL1A是IBD的易感基因之一,TL1A及其受体可通过影响肠黏膜T细胞的活化、增殖,诱导Th细胞极化,从而致肠黏膜免疫系统耐受机制紊乱,由此引发肠道炎症反应,从而参与IBD的发生。而慢性炎症反应是肠纤维化发生的首发因素,炎症反应可进一步激活肠成纤维细胞的活化,产生大量ECM,以致肠纤维化的形成。目的:探讨淋巴细胞高表达TL1A在DSS诱导的慢性实验性结肠炎相关肠纤维化中的作用,旨在为临床IBD及肠纤维化的治疗提供理论依据。方法:1 LCK-CD2-TL1A-GFP基因型的小鼠采用real-time Q-PCR的方法进行筛选与鉴定。2右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导建立小鼠肠纤维化的模型,将转基因型小鼠与C57BL/6野生型小鼠(体重20~25g,8~12周)分别随机分为Control、DSS组,每组6只小鼠。Control组给予饮用蒸馏水,DSS组给予间断饮用2%DSS水,共四周。饮用DSS的时间段为:第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天,第27、28天及其余时间饮用蒸馏水。3每日观察小鼠的食欲、体重、粪便性状、活动情况、精神状态、毛发光泽度、大便隐血(联苯胺法测定)及便血情况等,参照Cooper HS评分系统进行疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分,评估肠黏膜的炎症程度。4观察结肠形态学的变化,测量结肠的长度,计算结肠形态学评分、组织病理学评分以及测定结肠组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量,评估结肠炎症程度。5免疫荧光技术,检测CD4~+T淋巴细胞、IFN-γ、IL-17在小鼠肠组织中的定位表达,评估在慢性实验性结肠炎相关肠纤维化过程中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数量的变化。6提取脾脏、肠系膜淋巴结中(mesenteric lymph nodes,MLN)的单个核细胞,采用流式细胞术,检测CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数量,探讨在慢性实验性结肠炎相关肠纤维化过程中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数量的变化。7酶联吸附反应试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测IFN-γ、IL-17,评估在慢性实验性结肠炎相关肠纤维化过程中组织细胞相关细胞因子的表达情况。8 Masson染色与天狼猩红染色方法,检测结肠组织中胶原纤维的厚度,评估结肠纤维化的程度。9免疫组织化学检测I型胶原、III型胶原、Vimentin、α-smooth muscle actin(α-SMA)、以及TGF-β1/Smad3在小鼠结肠组织中的的表达。结果1根据基因LCK-CD2-TL1A-GFP的序列,测定小鼠的DNA,在192bp的位置是转基因小鼠的目的基因测定成像,而野生型小鼠基因测定成像,没有检测到该目的基因,根据此结果筛选并鉴定转基因的小鼠.2与Control组小鼠相比,野生型和转基因型小鼠DSS组的体重逐渐减轻,DAI评分逐渐升高,结肠壁明显充血水肿,结肠长度缩短;结肠组织病理结果显示:可见浅溃疡形成,炎症细胞浸润,病理评分升高(WT小鼠:11.75±0.50 vs 00.00±0.00,P<0.05;Tg小鼠:14.00±1.05 vs 0.00±0.00,P<0.05);MPO活性明显升高(P<0.05)。DSS组小鼠中,与WT小鼠相比较,Tg小鼠的DSS组结肠炎症程度增加(P<0.05).3免疫荧光检测IL-17、IFN-γ表达情况,DSS组小鼠中Tg小鼠与WT小鼠相比较,Tg小鼠IL-17的平均光密度显著升高(126.426 U/g±15.939U/g vs 84.528 U/g±11.967 U/g,P<0.05)。DSS组小鼠中,与WT小鼠相比较,Tg小鼠IFN-γ的平均光密度显著升高(115.428 U/g±13.933 U/g vs81.978 U/g±11.967 U/g,P<0.05)。4流式细胞术检测MLN、脾脏单个核淋巴细胞中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数量,在DSS组中,Tg小鼠与WT小鼠相比较,MLN单个核淋巴细胞中CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数的百分比明显升高(CD4~+IFN-γ+:8.04%±0.44%vs 6.71%±0.26%,P<0.05;CD4~+IL-17+:5.61%±0.19%vs 2.47%±0.28%,P<0.05);在DSS组中,Tg小鼠与WT小鼠相比较,脾脏单个核淋巴细胞中的CD4~+IFN-γ+、CD4~+IL-17+细胞数的百分比明显升高(CD4~+IFN-γ+:10.45%±0.66%vs 7.29%±0.58%,P<0.05;CD4~+IL-17+:3.33%±0.33%vs 2.10%±0.36%,P<0.05)。5 ELISA检测脾脏、LPMC、MLN的单个核细胞上清液中IFN-γ、IL-17的水平,结果显示:与Control组相比,DSS组中WT与Tg小鼠小鼠脾脏、LPMC、MLN中单个核淋巴细胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平升高,WT小鼠(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,277.484±9.211 pg/m L vs56.994±4.960 pg/m L,P<0.05;LPMC分泌的IL-17水平:31.628±1.055pg/m L vs 30.800±5.714 pg/m L,P<0.05);Tg小鼠(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,382.315±152.343 pg/m L vs 120.444±35.144 pg/m L,P<0.05;LPMC分泌的IL-17水平:36.143±8.630 pg/m L vs 35.744±1.446 pg/m L,P<0.05);DSS组中Tg小鼠与WT小鼠相比,脾脏、LPMC、MLN中单个核淋巴细胞上清液中的IFN-γ、IL-17水平明显升高(LPMC分泌的IFN-γ水平:1,382.315±152.343 pg/m L vs 1,277.484±9.211 pg/m L,P<0.05;LPMC分泌的IL-17水平:36.143±8.630 pg/m L vs 31.628±1.055 pg/m L,P<0.05)。6 Masson染色与天狼猩红染色观察胶原纤维染色程度,在DSS组中,与WT小鼠相比,Tg小鼠的Masson染色与天狼猩红染色肠纤维化程度明显加重(0.47±0.05 vs 0.36±0.016,P<0.05;0.40±0.01 vs 0.32±0.015,P<0.05)。7在DSS组中,与WT小鼠相比,Tg小鼠免疫组织化学染色检测Vimentin(0.80±0.02 vs 0.65±0.05,P<0.05)、α-smooth muscle actin(α-SMA)(0.60±0.04 vs 0.39±0.04,P<0.05)、I型胶原(0.67±0.08 vs 0.39±0.01,P<0.05)、III型胶原(0.83±0.04 vs 0.49±0.03,P<0.05)、以及TGF-β1(0.73±0.04 vs0.55±0.04,P<0.05)/Smad3(0.83±0.04 vs 0.59±0.02,P<0.05)表达均增加。结论:1 TL1A通过上调IFN-γ和IL-17的表达,促进实验性结肠炎小鼠肠黏膜炎症及肠纤维化的发生发展;2 TL1A促进肠成纤维细胞的增殖与活化,促进I型与III型胶原合成,从而加重慢性实验性结肠炎小鼠肠纤维化程度;3上调TGF-β1与Smad3的表达是TL1A促进实验性结肠炎小鼠肠纤维化的机制之一。