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第一部分不同时间点周期性牵拉对小鼠二型肺泡上皮细胞凋亡及DAPK1表达的影响目的离体研究不同时间点周期性牵拉刺激对小鼠二型肺泡上皮细胞凋亡及DAPK1的影响,摸索引起细胞凋亡的实验条件和DAPK1表达的变化规律。方法采用Flex-5000应力加载系统对小鼠二型肺泡上皮细胞(MLE-12)施以30%幅度,0.5Hz的正弦波式牵拉刺激,时间分别为6h,12h和24h。每个时间点根据不同的处理方式分为对照组和周期性牵拉组。为对比周期性牵拉与静态牵拉对细胞的不同影响,设置静态牵拉组,牵拉条件为30%拉伸幅度,0.5Hz, 24h,实验分为对照组与静态牵拉组。各组于牵拉结束后进行相应检测。差相显微镜观察细胞形态学改变;MTT法检测细胞活力;通过检测培养上清内LDH的含量评价牵拉刺激对细胞的损伤状况;采用流式细胞术检测细胞凋亡;Western bloting技术检测细胞内DAPK1、p-DAPK1及p-MLC的表达水平。结果6h时间点,与对照组相比,周期性牵拉组细胞形态不规则,部分细胞长角,细胞活力明显升高(P<0.05),培养上清内LDH含量增加(P<0.05),细胞凋亡水平无明显改变(P>0.05); DAPK1、p-DAPK1和p-MLC的表达无明显变化(P>0.05)。12h时间点,与对照组相比,周期性牵拉组细胞部分变圆并聚集成团,长角的细胞数量明显增加,细胞活力无明显改变(P>0.05),培养上清内LDH含量增加(P<0.05),细胞凋亡率增加,但无统计学意义(P>0.05); DAPK1、p-DAPK1及p-MLC表达无明显改变(P>0.05)。24h时间点,与对照组相比,周期性牵拉组细胞变圆,漂浮于培养基内,部分贴壁细胞聚集成团,自胞体长出细长丝状分支,细胞活力明显下降(P<0.05),培养上清内LDH含量明显升高(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05); DAPK1和p-MLC的表达明显增加(P<0.05),而p-DAPK1的含量则显著降低(P<0.05)。24h时间点,与对照组比较,静态牵拉组细胞形态稍有改变,细胞活力、培养上清内LDH含量和细胞凋亡水平均无明显改变(P>0.05)。DAPK1、p-DAPK1及p-MLC表达无显著改变(P>0.05)。结论大幅度周期性牵拉能明显改变细胞的生长形态及状态。短时间刺激在导致细胞损伤的同时增加细胞的活力,但不会导致细胞凋亡;随牵拉时间的延长,细胞细胞损伤加重,活力下降,凋亡水平上升。DAPK1的表达在周期性牵拉导致细胞凋亡时明显增加,并伴随其活性的增强(p-MLC水平上升);而无活性的p-DAPK1表达减少。相同条件下,静态牵拉不会引起细胞损伤及凋亡,对DAPK1、p-DAPK1及p-MLC表达无明显改变。第二部分DAPK1调控周期性牵拉诱导的小鼠二型肺泡上皮细胞凋亡目的探讨DAPK1是否参与了大幅度周期性牵拉引起的小鼠二型肺泡上皮细胞凋亡。方法实验分为A、B两个部分。A部分实验研究降低DAPK1表达是否能减少周期性牵拉诱导的细胞凋亡。实验分组:对照组(control);对照si-RNA+周期性牵拉组(control-si+CS):转染对照 RNA; DAPK1-siRNA+周期性牵拉组(DAPK1-si+CS):转染DAPK1干扰RNA以降低DAPK1的表达。牵拉条件:30%牵拉幅度,0.5Hz,24h。实验结束后,采用差相显微镜观察细胞形态学的改变;MTT法检测细胞活力,同时检测上清液内LDH含量,流式细胞术检测细胞凋亡水平。B部分,研究增加DAPK1表达能否诱导细胞凋亡。实验分组:对照组(control);对照质粒组(control plasmid):转染对照质粒;DAPK1-CaM质粒组(DAPK1-CaM):转染具有催化活性的DAPK1-CaM质粒。转染后培养48小时后收集细胞与培养上清做相应检测。采用差相显微镜观察细胞形态学改变,检测细胞活力及培养上清内LDH含量,流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果A部分结果表明,与control-si+CS组相比,DAPK1-si+CS组细胞形态改变减轻,变圆及长出分支的细胞数量明显减少,细胞活力明显上升(P<0.05),培养上清内LDH的含量下降(P<0.05),细胞凋亡水平降低(P<0.05); B部分结果显示,与control plasmid组相比,DAPK1-CaM质粒组细胞形态改变明显,绝大多数细胞变圆并悬浮于培养基内,细胞活力明显下降(P<0.05),培养上清内LDH含量显著增加(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05)。结论DAPK1参与了周期性牵拉诱导的肺泡上皮细胞凋亡;减少DAPK1的表达能够抑制细胞凋亡,DAPK1过表达则促进了肺泡上皮细胞的凋亡。第三部分DAPK1通过诱导肺泡上皮细胞凋亡促进机械通气肺损伤的发生目的在体研究DAPK1是否通过诱导肺泡上皮细胞凋亡参与机械通气肺损伤的发生以及抑制DAPK1的表达和活性能否缓解机械通气肺损伤方法实验分为A和B两部分。A部分,研究不同潮气量机械通气对小鼠肺泡上皮细胞凋亡及DAPK1表达与活性的影响。SPF级雄性C57小鼠24只,6-8周龄,体重23-25g,随机分为三组(n=8): (1)对照组(control):不做任何处理;(2)小潮气量机械通气组(LVt):潮气量8ml/kg,呼吸频率为120次/分钟;(3)大潮气量机械通气组(HVt):潮气量35ml/kg,呼吸频率均为80次/分钟。各组通气时间均为4h。实验结束后腹主动脉放血处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)及肺组织。小鼠肺组织HE染色观察肺组织病理学改变;检测BALF内总蛋白浓度,细胞总数;肺组织湿干重比;tunel染色计数肺组织细胞凋亡数量;肺组织内DAPK1、p-MLC含量采用westernbloting技术检测。B部分,研究抑制DAPK1表达后,大潮气量机械通气对肺泡上皮细胞凋亡的影响。实验采用SPF级雄性C57小鼠24只,6-8周龄,体重23-25g,随机分为三组(n=8): (1)对照组(control):不作任何处理;(2) DMSO干预组(DMSO): 10%DMSO腹腔连续注射4周后,给予机械通气,潮气量 35ml/kg; (3) DAPK1 抑制剂(DAPK1 inhibitor)干预组(DI): DI以500μg/kg腹腔连续注射4周,给予机械通气,潮气量35ml/kg。机械通气的呼吸频率均为80次/分钟,通气时间为4h。通气结束后腹主动脉放血处死小鼠,收集标本检测。小鼠肺组织HE染色观察病理学改变;肺组织湿干重比;检测BALF内总蛋白浓度,细胞总数;肺组织上皮细胞凋亡采用Tunel染色法检测;Western bloting法检测肺组织内DAPK1、P-MLC及P53表达。结果A部分:HE染色与control组相比,LVt组肺泡结构稍有塌陷、破坏,无明显炎症细胞的浸润;而HVt组肺泡结构明显破坏,肺泡间隔增厚,炎症细胞浸润,肺组织有广泛的出血;与control组相比,LVt组BALF内蛋白浓度、细胞计数与肺组织湿干重比均无显著差异(P>0.05),而HVt组各项指标均显著升高(P<0.05); Tunel结果表明,与control组比较,LVt组肺泡上皮细胞凋亡并不增加(P>0.05),而HVt组肺泡上皮细胞凋亡明显增多(P<0.05);小鼠肺组织内DAPK1及P-MLC含量与control组比较,LVt组无明显改变(P>0.05),HVt组则明显升高(P<0.05)。B部分:HE染色结果显示,给予DAPK1抑制剂后,与DMSO组相比,小鼠肺组织病理学破坏有明显的缓解;BALF内蛋白含量、细胞计数及肺组织湿干重比较DMSO组均明显减少(P<0.05); Tunel染色结果表明,与DMSO组比较,DI组肺泡上皮细胞凋亡明显减少(P<0.05 );与DMSO组相比,DI组DAPK1、P-MLC及P53含量明显降低(P<0.05)。结论小潮气量机械通气不会对肺组织造成损伤,不引起肺泡上皮细胞凋亡及DAPK1表达、活性的改变;大潮气量机械通气能够引起肺组织损伤,肺泡上皮细胞凋亡,DAPK1表达及活性增加;DAPK1抑制剂预处理能减少大潮气量机械通气引起的肺泡上皮细胞凋亡,减少DAPK1的表达及活性,对机械通气诱导的肺损伤有一定的保护作用。