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牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛以腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染,母畜流产、死胎和畸形胎等为临床特征的一种重要的传染病。BVDV呈世界性分布,其宿主谱相当广,除了可以感染各个年龄段的牛之外,还能感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及多种野生动物,且其易感动物群正呈逐渐扩大的趋势。BVDV有两个基因型,即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1的发现早,分布比较普遍,流行于世界各个国家,而BVDV-2在20世纪80年代末才首次分离于加拿大和美国爆发的急性BVD中。BVDV-1和BVDV-2感染表现的临床症状很相似,但BVDV-2还能引起严重的血小板减少症和出血综合症。我国在1980年首次分离报道了BVDV-1,随后在各地区都相继报道了该病毒的感染,目前,已有二十多个省市报道,说明BVDV-1在我国牛群流行普遍。2009年,我们实验室首次分离报道了BVDV-2,说明BVDV-2也开始出现在我国并可能流行。目前为止,关于BVDV-2在我国流行的详实情况还不是很清楚,该方面数据比较少。因此,本研究将集中如下三部分：一、目前国内BVDV的流行病学调查；二、对BVDV分离株的特性进行研究；三、对BVDV分离株进行基因测序分析及分型。上述研究旨在为目前我国牛病毒性腹泻病毒的流行提供资料,丰富该方面的数据,为进一步研究针对BVDV-1和BVDV-2的疫苗奠定基础。研究一：从我国各省不同地区的养牛场采集疑似BVDV感染牛的临床病料组织(脾、淋巴结、心肌、血液等),共127份。将样品初步处理后,用我们实验室建立的双抗夹心ELISA检测抗原。经ELISA检测为阳性的样品接种于MDBK细胞,进行病毒分离。样品在MDBK细胞上经3次传代后取提RNA,设计针对BVDV-1、BVDV-2和针对BVDV-1和BVDV-2两型的特异性引物,用我们实验室建立的RT-PCR方法进行鉴定。结果表明,在所检测的样品中,BVDV-2阳性11份(8.66%),所检病料中没有检出BVDV-1。上述研究表明,BVDV-2在我国牛群中已有广泛流行。研究二：经检测为BVDV2阳性的病料样品接种MDBK细胞,获得11株BVDV-2野毒株。分离到的11株BVDV-2分别盲传培养至18代时仍不见任何典型的细胞病变。间接免疫荧光试验证明分离的野毒株能与鼠源的重组BVDV-2E2蛋白抗血清发生免疫反应,产生特异性胞内荧光；而与针对BVDV-1E2蛋白的单抗不发生反应。将病毒感染的MDBK细胞制备超薄切片,电镜观察可见感染细胞的内质网中有约60nm大小的病毒粒子；经差速离心和20%蔗糖垫底超速离心纯化病毒,将提纯的病毒经磷钨酸染色,在电镜下能观察到大小约60nm有囊膜的病毒颗粒。研究三：提取病毒RNA,并反转录为cDNA。设计针对BVDV5’-UTR、Npro、 E2和NS2-3的引物,以cDNA为模板分别扩增分离株的5’-UTR、Npro、E2和NS2-3基因片段。采用“TA”克隆法,将所扩增的片段连接到PMD18-T Vector上,经转化筛选出阳性克隆,并送去测序。通过5’-UTR序列进化树分析,结果表明11株分离株均为BVDV-2。比较这11株分离株的Npro、E2和NS2-3基因与GenBank中已发表的BVDV序列的同源性,结果表明,我们的这11株分离株的Npro、E2和NS2-3基因与890、XJ-04、p11Q、p24515、NewYork’93、NADL、Osloss、CD7、1373、 SD-1、KS86-lncp、Oregon C24V毒株的E2和NS2-3基因的核苷酸同源性分别为93.1%-67.1%,92.2%-63.2%,91.7%-64.2%,且这11株分离株均与XJ-04株(国内最早分离株)亲缘性最近。