造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment,HIM）是支持和调节造血干细胞（haemopoietic stem cells,HSCs）生长发育的内环境，其结构和功能的完整是维系正常造血功能的重要因素。基质细胞作为HIM的核心组分，不仅通过形成HSCs生长发育的“龛”、分泌造血因子和细胞外基质等方式支持和调控HSCs自我更新与分化，还与多种血液系统疾病的发生、发展和预后密切相关。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood-derived stromal cells,hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究。我们的前期体外研究证实hUCBDSCs具有造血基质细胞的基本生物学特征，能有效支持脐血CD34+细胞数量扩增；动物实验也表明，hUCBDSCs与造血细胞联合移植于辐照后裸鼠体内具有促进造血重建、修复受损微环境和减轻移植物抗宿主病（GVHD,graft-versus-host disease）的多重效应。　　然而随着研究的深入，我们发现hUCBDSCs存在移植后存活状况差和植入效率较低等问题，分析主要原因可能是在体外培养和体内输注过程中会面临营养缺乏、炎症反应和氧化应激等多种不良因素刺激。这些因素导致胞内自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量增加，细胞结构破坏和功能失调，进而造成细胞衰老、死亡或凋亡。线粒体是细胞内ROS的主要来源，也是最先被攻击的细胞器。线粒体ROS（mitochondrial ROS,mtROS）的稳态调节是维系线粒体和细胞正常功能的关键所在。线粒体氧化应激，即mtROS的产生与抗氧化防御之间的不平衡，将导致线粒体功能障碍及一系列相关疾病。为确保hUCBDSCs活力和移植疗效，研究如何提高细胞内源性抗氧化保护功能和维持mtROS稳态调节的有效途径具有重要的理论价值和应用前景意义。　　人参是中医临床“补气要药”，已有数千年的临床用药历史。现代医学研究认为，人参皂苷是人参中主要的药理学活性成分，有多达几十种皂苷，人参皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1,G-Rg1）是其中最重要的单体皂苷成分之一。本课题组和其他学者的研究证实，人参皂苷 Rg1在抗肿瘤、抗炎症、抗衰老、抗糖尿病、抗神经原退化和促干/祖细胞增殖等方面有广泛药理学作用。近年来研究还发现，人参皂苷Rg1具有拮抗氧化致衰剂对多种器官和细胞的氧化损伤与促细胞凋亡作用，提示人参皂苷Rg1是人参中重要的抗氧化皂苷。课题组既往研究证明，人参皂苷 Rg1不仅能促进骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）增殖分化与造血生长因子分泌，还能通过增强其在D-半乳糖诱导的应激条件下的抗氧化和抗炎能力以延缓细胞衰老。然而，人参皂苷Rg1是否对于氧化应激诱导的hUCBDSCs损伤与凋亡发挥一定的保护作用以及可能的分子机制尚未见相关报道。　　目的：在本研究中，我们体外分离、培养和扩增hUCBDSCs，并采用叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,t-BHP）损伤hUCBDSCs构建氧化应激损伤细胞模型，研究人参皂苷Rg1拮抗hUCBDSCs氧化损伤、促进细胞存活、抑制凋亡以及维持线粒体ROS稳态的重要作用，深入探索转录调控因子叉头框蛋白O3a（Fokhead box O3a,FoxO3a）介导的相关信号通路在人参皂苷Rg1发挥这些效应中的作用。旨在为阐释人参皂苷Rg1抗氧化效应的现代分子生物学机制提供新的理论依据；为提高hUCBDSCs临床移植治疗效果提供新的辅助手段。　　方法：　　1．体外分离、培养和扩增hUCBDSCs，采用t-BHP处理细胞构建氧化应激损伤体外模型。分别以不同浓度人参皂苷Rg1处理损伤后的hUCBDSCs，CCK-8法检测人参皂苷Rg1对hUCBDSCs细胞活力、细胞增殖的影响，在倒置相差显微镜下观察成纤维细胞集落形成单位（colony-forming unit of fibroblast,CFU-F）的形成。以试剂盒分别检测氧化应激相关指标，包括丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）的活力。　　2．采用不同浓度人参皂苷Rg1分别处理t-BHP诱导的hUCBDSCs，流式细胞术检测细胞凋亡率，阐明人参皂苷Rg1对细胞凋亡的影响。Western blot法检测人参皂苷Rg1对t-BHP诱导的hUCBDSCs凋亡相关蛋白（Caspase-3、Bim、Bax和Bcl-2）表达水平的影响。Western blot法检测Akt-FoxO3a信号通路在人参皂苷Rg1下调Bim蛋白表达水平中的作用，Western blot法检测人参皂苷Rg1对FoxO3a在hUCBDSCs中胞核/质转位的调节作用。　　3．采用不同浓度人参皂苷Rg1处理t-BHP诱导的hUCBDSCs，激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope, LSCM）分别检测人参皂苷Rg1对总ROS和mtROS生成的影响，利用LSCM检测人参皂苷 Rg1对 t-BHP诱导的 hUCBDSCs线粒体膜电位（MMP, mitochondrial membrane potential）的影响。以试剂盒检测人参皂苷Rg1对锰超氧化物岐化酶（Mn-SOD）和过氧化氢酶（Catalase）活力的影响。采用CCK-8法、LSCM和相应试剂盒检测等方法明确Sirt1在人参皂苷Rg1阻抑线粒体氧化损伤中的作用，Western blot法检测AMPK-Sirt1信号通路在人参皂苷Rg1上调FoxO3a去乙酰化水平中的作用。　　结果：　　1．成功构建t-BHP诱导hUCBDSCs的氧化应激损伤体外模型　　研究发现，不同浓度t-BHP损伤hUCBDSCs后，细胞存活率随t-BHP浓度的增加而逐渐降低。在t-BHP浓度（80μM）处理细胞6h时，细胞存活率降至（52±3.10）%，即IC50约为80μM。根据上述实验结果，以80μM剂量t-BHP处理细胞6h的方法构建t-BHP诱导hUCBDSCs的氧化应激损伤体外模型。　　2．人参皂苷Rg1抑制t-BHP诱导的hUCBDSCs损伤和凋亡　　（1）在本研究涉及的浓度范围内，人参皂苷Rg1能浓度依赖的抑制t-BHP诱导hUCBDSCs的活力下降，当人参皂苷Rg1浓度为0.1、1、10和50μM时作用最为显著。人参皂苷Rg1（50μM）还对t-BHP诱导的细胞增殖下降和CFU-F形成减少具有明显的恢复作用，且对于正常hUCBDSCs也具有一定促增殖作用。　　（2）t-BHP损伤hUCBDSCs后MDA含量和LDH酶活性显著上升，而SOD酶活性明显降低。不同浓度（1、10和50μM）人参皂苷Rg1处理均能显著降低MDA和LDH水平；当浓度为10μM和50μM时人参皂苷Rg1还能明显提高SOD的酶活性。　　（3）t-BHP损伤hUCBDSCs后凋亡率较正常组显著增加，而不同浓度（1、10和50μM）人参皂苷Rg1处理均能够有效抑制t-BHP诱导的hUCBDSCs凋亡。人参皂苷Rg1（50μM）还能显著抑制促凋亡蛋白酶Caspase-3的活化、降低促凋亡蛋白Bim和Bax的表达及提高抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。　　3．Akt-FoxO3a-Bim信号通路在人参皂苷Rg1抑制凋亡中的作用　　人参皂苷Rg1（50μM）能激活Akt和FoxO3a磷酸化，促进FoxO3a由胞核向胞质转位，这一改变抑制了FoxO3a对下游凋亡诱导基因Bim的表达调控，进而下调了促凋亡蛋白Bim和Bax的表达，并上调了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。而人参皂苷Rg1作用能被PI3K抑制剂LY29004所抑制，提示Akt-FoxO3-Bim信号通路在人参皂苷Rg1阻抑t-BHP诱导hUCBDSCs的凋亡中发挥重要作用。　　4．人参皂苷Rg1减轻t-BHP诱导的线粒体氧化损伤　　（1）激光扫描共聚焦显微镜检测发现，t-BHP损伤hUCBDSCs后DCFH-DA荧光强度较正常对照组明显升高，提示胞内总ROS水平上升。不同浓度（1、10和50μM）人参皂苷Rg1处理细胞后总ROS水平随着人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐下降，表明人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的胞内活性氧水平提升。　　（2）激光扫描共聚焦显微镜检测发现，t-BHP损伤hUCBDSCs后MitoSOX Red红色荧光变强，线粒体O2·-水平明显升高。人参皂苷Rg1浓度依赖的抑制t-BHP诱导的线粒体O2·-增加，当其浓度为10μM和50μM时，O2·-水平显著低于t-BHP单处理组，提示人参皂苷Rg1具有降低线粒体活性氧水平的作用。　　（3）激光扫描共聚焦显微镜观察JC-1探针标记的hUCBDSCs，并采用红/绿色荧光强度的比值代表线粒体膜电位（Δψm）。结果表明，与正常对照组比较，t-BHP处理细胞后Δψm明显降低。不同浓度（1、10和50μM）人参皂苷Rg1处理细胞后Δψm随人参皂苷Rg1浓度增加而逐渐增加，提示人参皂苷Rg1能抑制t-BHP诱导的hUCBDSCs线粒体膜电位丢失。　　（4）t-BHP损伤hUCBDSCs后导致Mn-SOD和Catalase的酶活力下降，而人参皂苷Rg1处理能浓度依赖的提高这两种线粒体抗氧化酶的活力。当人参皂苷Rg1浓度为10μM和50μM时，Mn-SOD酶活力水平显著高于t-BHP单处理组；人参皂苷Rg1浓度为1、10和50μM时，Catalase酶活力较t-BHP单处理组有显著提高。结果提示人参皂苷Rg1可通过提高Mn-SOD和Catalase酶活力发挥线粒体抗氧化作用。　　5．AMPK-Sirt1-FoxO3a信号通路在人参皂苷Rg1调控线粒体活性氧水平中的作用　　（1）人参皂苷Rg1（50μM）能显著提高t-BHP诱导的hUCBDSCs细胞Sirt1的表达水平，且对于正常细胞Sirt1的表达也有促进作用。使用Sirt1的siRNA干扰后，人参皂苷Rg1对线粒体O2·-生成的抑制作用被明显减弱，Mn-SOD和Catalase酶活性降低，细胞活力也随之下降，提示Sirt1活化对于人参皂苷Rg1发挥线粒体抗氧化作用是必要的。（2）t-BHP损伤hUCBDSCs后磷酸化的AMPK、Sirt1表达及去乙酰化的 FoxO3a表达水平均明显降低。与 t-BHP处理组比较，人参皂苷Rg1（50μM）能显著促进AMPK磷酸化激活和上调Sirt1表达水平，进而提高FoxO3a去乙酰化水平。分别利用AMPK siRNA和Sirt1 siRNA干扰处理后，人参皂苷Rg1这一系列效应被抑制，表明人参皂苷Rg1能够通过激活AMPK-Sirt1信号通路促进FoxO3a去乙酰化，进而上调FoxO3a介导的Mn-SOD和Catalase两种酶的表达,发挥线粒体活性氧清除作用。　　结论：　　1．人参皂甙Rg1能够促进t-BHP诱导hUCBDSCs的存活、提高增殖能力，并通过调控Akt-FoxO3a-Bim信号通路在抑制细胞凋亡过程中发挥重要作用。　　2．人参皂苷Rg1通过清除过多mtROS来保护hUCBDSCs免受t-BHP诱导的线粒体氧化损伤，而这一效应主要受到AMPK-Sirt1-FoxO3a信号通路的调控。