大豆高效转基因技术体系的建立及Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白(TaNHX2)基因的导入研究

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大豆是重要的粮食、油料和饲料作物,也是人类蛋白质食物、工业原料的主要来源之一,大豆在医药保健以及防病治病方面,也有一定的用途。全世界抗除草剂转基因大豆的迅速发展,展示了转基因育种在大豆品种改良中的广阔发展前景。与此形成鲜明对比,我国大豆转基因育种进展缓慢,主要原因是遗传转化操作转化效率低、转化植株再生频率低以及重演性差等。因此,建立理想的、高效的大豆转化体系是目前研究热点之一。   本研究利用大豆子叶节为外植体,用含植物双元表达载体pBIN438-35S-TaNHX2的农杆菌AGL1对大豆进行转化,探索外植体大小、培养基主要成分、培养时间等因素对外植体分化的影响,旨在优化遗传转化条件,提高大豆转基因的遗传转化效率,培育抗逆相关的小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因(TaNHX2)的转基因大豆新种质。   主要结果如下:   1、鉴定出再生率高的大豆基因型。15个不同基因型大豆子叶节,用农杆菌菌株(含pBIN438质粒)AGL1浸染时,不同基因型的丛生芽获得率和再生率差异显著,变化范围分别为22~73%和4~58%,从中筛选出适合大豆遗传转化的基因型,包括中豆32、吉林小粒1号、绥农14和早熟18等品种。研究发现,转化率和再生率高的大豆基因型,对农杆菌也比较敏感。   2、研究了pH值和6-BA对遗传转化的作用。利用早熟18研究了大豆转化条件,研究表明,在诱导丛生芽阶段,既有利于激素进入植物细胞,又适于大豆自生生长发育的最适pH值为5.7。在培养中豆32时,在萌发和不定芽2种培养基中都加入6-BA,丛生芽率比不加和只在单个培养基加6-BA提高0.7倍以上。   3、建立了最佳的遗传转化方法。通过对萌发培养基6-BA浓度(A)、诱导丛生芽培育基6-BA浓度(B)、浸染时间(C)、共培养时间(D)这四个因素的正交试验分析,结果表明,四个因素对抗性芽伸长诱导的效果存在较大差异。最佳的遗传转化方法为大豆萌发和不定芽诱导时分别加入0.5 mg L-16-BA和1.0 mg L-16-BA,浸染时间为30min、共培养时间为3d;外植体大小为2/3子叶,kan抗性筛选浓度第一阶段和第二阶段分别是60和50 mg L-1。   4、培育出转基因大豆新材料。利用筛选出的最佳遗传转化方法,对中豆32子叶节进行抗逆相关的小麦Na+/H+逆向转运蛋白基因(TaNHX2)遗传转化,获得转基因再生植株,经PCR分子检测,证明目的基因TaNHX2已导入并整合到大豆基因组中,转化率为3.78%。
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