本研究在实验室前期获得大黄鱼(Larimichthys crocea)两种类型TLR5(LcTLR5M,LcTLR5S)cDNA序列的基础上,分别克隆了它们的启动子序列,通过片段缺失,定点突变等技术,筛选并验证了其启动子结构及转录结合位点;构建了LcTLR5M和LcTLR5S的亚细胞定位质粒,研究了其在细胞内的表达特征;构建了它们的过表达质粒,将其分别以及共同与NF-κB家族p65基因启动子共转染细胞系,检测了LcTLR5M和LcTLR5S过表达对NF-κB-p65启动活性的影响。克隆了大黄鱼NF-κB家族RelB基因的全长cDNA序列,分析了它的分子结构及组织表达谱,检测了病原相关分子模式(PAMP)刺激后,其在细胞系内的时空表达特征;研究了RelB亚细胞定位并分析了其过表达后对TNF-α等部分细胞因子的影响及IκB家族IκB-α对其调控机制。扩增了NF-κB家族成员p65基因的启动子序列,检测了其活性,以及病原刺激后对其启动活性的影响;研究了p65基因亚细胞定位及分析了其过表达对下游细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I基因的启动子活性的影响,及IκB-α对其调控机制。结果如下:(1)大黄鱼TLR5M启动子区域在-1829bp至+189bp之间,无CpG岛区域,转录结合位点含有CEBP、Oct-1、GATA-1、AP1等元件,系列片段缺失分析基本启动子活性所需的顺式作用元件可能位于-417至+189之间,负调控元件可能位于-799至-417之间。大黄鱼TLR5S启动子区域在-1932bp至+106bp之间,无CpG岛区域,转录结合位点含有CEBP、SP1、Oct-1、AP1、NF-B等元件,片段缺失表明TLR5S基因顺式作用元件可能位于-808至+106之间,Oct-1和NF-κB结合位点对TLR5S启动子活性有正调控作用且大黄鱼NF-κB家族亚基p65过表达可显著上调TLR5S启动子活性,表明预测正确。亚细胞定位分析表明,大黄鱼TLR5M蛋白主要定位在细胞膜上,而TLR5S蛋白主要定位在细胞浆中。TLR5M过表达对NF-κB-p65启动子的活性无显著影响,而TLR5S过表达可以显著上调NF-κB-p65启动活性。(2)大黄鱼RelB(LcRelB)基因全长为1946bp,ORF为1788bp,编码595个氨基酸,包含RHD-DNA-bind结构域和IPT结构域,等电点p I=5.6,分子量为66.5KDa。进化分析表明,大黄鱼RelB基因与红鳍东方鲀亲缘关系最近;LcRelB广泛分布于多种组织,其中在血细胞中含量最高,其次是脾脏和头肾,皮肤中含量最低;LPS和poly I:C刺激后,大黄鱼LCK细胞系中LcRelB上调表达显著,而PGN免疫刺激后表达下调(p<0.05)。LcRelB蛋白定位于细胞核中。LcRelB过表达后,其下游细胞因子IL-1β启动子活性显著下调,而TNF-α和IFN-I启动子活性显著上调(p<0.05),而当NF-κB家族抑制因子Lc IκB-α与其共转染后,可以显著抑制TNF-α启动子活性(p<0.01)。(3)Lcp65启动子区域为-1695bp至+111bp,预测其转录结合位点含有USF、AP1、SRF、IRF-1、NF-κB等元件,含有CpG岛以及(GT)n重复区域;LPS,PGN,Flagellin刺激后均能够显著诱导p65启动活性上调,其中Flagellin诱导能力最为显著(p<0.01);亚细胞定位表明,Lcp65蛋白主要定位于细胞核中;Lcp65过表达后能显著上调其下游细胞因子IL-1β、TNF-α和IFN-I启动子的活性,其中,TNF-α的启动活性最强。抑制因子Lc IκB-α与其共转染后,可以显著抑制其对TNF-α启动子活性的诱导(p<0.01)。