第一章一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法背景干细胞是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,存在于许多组织中；根据其发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)是成体干细胞的一种,可分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞。跟据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,前者主要包括肝卵圆细胞、小肝细胞,后者主要起源于骨髓干细胞和胚胎干细胞。目前研究肝干细胞已成为世界范围的热点,由于它具有来源广泛、增殖能力强、移植细胞体积小等传统肝细胞无可比拟的优点,可以预测它将替代肝脏移植和肝细胞移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源。正是由于肝干细胞治疗各种原因引起的肝病具有无可比拟的优势,因此探讨如何获得高纯度的肝干细胞及其特异性的标志物有重要的现实意义。正常情况下,体内肝干细胞多处于静息期,数量极少,分离时常先经药物或手术造成肝脏损伤,肝脏灌流或联合细胞分离液分离来获得肝干细胞,操作复杂且成本较高。相比较传统的肝干细胞分离培养方法而言,本实验室首次采用先机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,简单的离心分离法和胰蛋白酶选择性消化法相结合,从孕15天大鼠胎肝组织中成功分离出肝干细胞。此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为其作为组织工程种子细胞提供了实验基础。目的改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。方法1、购清洁级别近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进行进一步的纯化,得到较为纯化的肝干细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,显微镜下观察细胞贴壁情况及形态学变化。2、将卵圆细胞接种于预先用0.2%明胶处理的盖玻片上置于24孔培养板中,37℃,5%CO2孵箱培养24小时,至细胞长成单层后行免疫荧光化学检测。细胞消化传代,对P10代细胞进行免疫组织化学检测。分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物CD34、C-Kit、0V6、CK19的表达情况结果分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形。经1-2次差异性消化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强。免疫细胞化学检测示：P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋白(CK)19呈阳性表达,不表达ALB。P10代肝干细胞C-Kit、 CK19、OV-6及CD34呈阳性表达。结论此方法在原代即可获得形态均一、增殖速度快、性状稳定的LSCs,且具有操作简单、快捷、实用、对细胞损伤小等优点,为深入研究肝干细胞生物学特性和进行体内移植实验提供了物质基础。第二章大鼠肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞在肝再生中的作用背景长期以来,成熟肝细胞和卵圆细胞在损伤肝的再生中如何发挥作用一直是肝干细胞研究领域的核心问题,对两者在损伤肝再生中的作用也有着不同的观点。一方面,有报道认为部分肝切除(partial hepatectomy, PH)后大鼠肝可在二周内再生并恢复至原来大小,有人连续进行了12次PH后发现仍能完成肝再生：这种肝再生多被认为是单独由成熟肝细胞分裂增殖完成的。另一方面,在损伤肝再生中发挥了作用的、起源于门管区小胆管和Hering’s管的卵圆细胞(OVC)被认为可能是肝内源性的具有肝胆双向分化潜能的成体肝干细胞。目前,为研究成体肝脏中肝干细胞的增殖、分化,研究者们采用各种不同的方法抑制肝细胞增殖,并采用药物(如CCl4)或肝部分切除术等诱导肝脏急性损伤,以激活肝脏干细胞。从而研究肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。本研究鉴于RS是公认的能长期抑制成熟肝细胞分裂增生的肝化学毒剂,而PH又能给予强烈的肝再生需求,我们建立了肝脏切除及其联合应用倒千里光碱导致肝脏急性损伤的大鼠模型,通过对Rs/PH和1/3PH后肝再生过程中成熟肝细胞和卵圆细胞的比较病理学研究,并依据研究中观察到的一系列现象,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。目的联合应用倒千里光碱(RS)和肝脏1/3切除术(1/3PH)建立大鼠肝损伤模型。观察大鼠肝损伤后肝细胞和卵圆细胞增殖情况,探讨关于肝损伤后成熟肝细胞和卵圆细胞与肝脏再生的关系。方法1、30只大鼠随机分为2组,每组15只。倒千里光碱／肝脏1/3切除组(RS/PH组)：取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光碱溶液30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周。肝脏1/3切除组(1/3PH组)：用生理盐水代替倒千里光碱,腹腔注射30mg/kg,共注射2次,每次间隔2周,第2次腹腔注射4周后,两组大鼠行肝脏1/3切除术。2、分别于术后第3、7、14、20天处死大鼠,10%甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,采用苏木精-伊红染色,BrdU注射及BrdU免疫荧光化学检测,CK19、 C-Kit免疫组织化学检测观察两组大鼠术后不同时间点肝脏病理形态变化、细胞增殖情况和CK19、C-kit免疫组化检测情况结果RS/PH组大鼠术后20d体质量仍低于术前,肝脏增大明显小于1/3PH组,HE染色示胞体肿大、胞浆疏松、肝细胞广泛空泡变性,汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生；1/3PH组术后20d体质量恢复接近术前,肝脏损害较RS/PH组轻,Brdu免疫荧光示成熟肝细胞大量增生,术后14d见肝OVC增生,多出现在肝细胞索中,形态和免疫组化标记与RS/PH组OVC一致。结论成功构建了倒千里光碱联合肝脏1/3切除术的急性肝损伤大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞和成熟肝细胞增殖的现象,证实肝细胞更新与损伤后再生是肝流域中肝内外源肝干细胞及成熟肝细胞共同作用的结果。第三章GFP转基因小鼠胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究背景各种原因引起的急、慢性肝功能衰竭的发病率和死亡率很高,已成为威胁肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植(OLT)已被证明是治疗各种肝功能失代偿期、肝功能衰竭期最有效的治疗方法,但因为肝源缺乏、费用昂贵、以及移植后并发症多等限制了OLT的广泛应用。近年来,新的干预性治疗不断出现,肝细胞移植已开始应用于一些动物模型和人类临床实验,但由于肝细胞来源不充足,人们仍然希望能够获得大量更安全的细胞来源。肝干细胞的移植为此开拓了新的途径,肝干细胞是一种多能干细胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝细胞和胆管细胞分化的能力,在体内可以分化为肝细胞和胆管细胞,参与肝脏的发生发育及损伤后修复等生理病理过程。若能将其大量扩增后再进行移植,就可能从量上解决细胞来源短缺的问题。肝干细胞移植相对于肝细胞具有更大的优势：(1)肝干细胞具有更大的增殖能力,植入受体后增殖能力强,较少的移植细胞数就能达到较好的增殖效果；(2)移植肝内后能分化为肝细胞和胆管上皮细胞,对肝组织结构重建及功能恢复更为有利,更为重要的是,肝细胞增殖需要受肝存在选择压力,而肝干细胞在正常肝脏环境中就能大量增殖,为受体肝脏的再生及肝功能恢复提供机会；(3)肝干细胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母细胞中不表达经典的MHC-1分子,在肝干细胞同种异体移植时能引起免疫逃逸。移植失败现象较肝细胞移植少,对受体影响小；(4)肝干细胞直径(10-12μm)较肝细胞(20-35μm)小,更容易通过肝窦到达肝脏各叶,使其定植及扩增效率增加。而肝细胞移植浓度较高时部分细胞则不能通过汇管区小血管。因此肝干细胞可以作为生物型人工肝和肝细胞移植最理想的细胞来源,从而在肝病基因治疗中发挥重要作用,并有望成为取代严重肝功能衰竭患者肝移植的替代疗法,具有很大的研究前景。本研究对L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠进行GFP转基因小鼠胎肝干细胞移植,结果表明本实验室建立的肝干细胞系能够成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝脏中,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。而在未作预处理的正常大鼠肝脏中未见GFP+肝干细胞。虽然我们并不能明确移植的胎肝干细胞在肝内增殖程度,但从肝脏中GFP阳性的细胞比例比较,L-CL2MDP/RS/PH实验组比正常对照组具有明显的优势。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。今后我们将扩展这一研究成果,努力与临床实践相结合,并回答移植研究中尚待解决的排斥免疫学机制问题。目的1、从荧光转基因小鼠胎肝中获得稳定表达GFP蛋白的肝脏干细胞2、联合应用L-CL2MDP/RS/PH,建立适合肝脏干细胞移植的大鼠动物模型,进一步提高肝干细胞的移植效率。方法：1、孕15d绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠,体重40-60g,SPF级150g左右SD雄性大鼠30只,GFP转基因小鼠胎肝干细胞的分离、体外培养与传代及免疫组化鉴定2、建立L-CL2MDP/RS/PH动物模型,将分离的胎肝干细胞通过脾脏注射移植到大鼠肝脏,检测细胞移植后GFP蛋白的表达,以及免疫组化检测C-Kit、 AFP明确移植的肝干细胞在肝脏内是否增殖。结果1、倒置显微镜下见分离的肝干细胞大小均匀,呈鹅卵石形态。接种培养瓶24h细胞开始贴壁并伸展；培养5d后细胞体积增大,呈梭形或多角形,荧光显微镜可观察到细胞发出绿色荧光。传代3次后,细胞状态良好,在荧光显微镜下可见炫目的绿色荧光,免疫组化检测P3代细胞CD34、AFP呈阳性表达,。2. HSCs经脾脏移植后3d在荧光显微镜下观察两组大鼠的肝脏冰冻切片,发现L-CL2MDP/RS/PH组大鼠肝内散在分布GFP阳性细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组大鼠肝内未见GFP阳性细胞。移植后30d移植大鼠肝脏内仍可见GFP阳性表达,阳性细胞成团聚集、局灶状分布,细胞形态与肝细胞相似。结论1、从GFP转基因小鼠肝脏中成功分离出胎肝干细胞,分离的细胞原代形态均一、增殖速度快、传代3次后均可以稳定而强烈表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的细胞能够在受体大鼠肝脏中存活,并且出现不同程度的增殖。说明L-CL2MDP/RS/PH模型能够提供一个相对较好的肝干细胞植入的环境。这为研究适用于细胞移植的实验动物模型提供了一些有价值的信息。小结1、改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力。本研究选择大鼠胚胎肝脏作为细胞来源,采用机械剪碎酶消化法分离获得肝干细胞,后经简单的离心分离法以及胰蛋白酶选择性消化法进一步纯化,得到较纯净的大鼠胎肝干细胞。利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物,证实本研究分离培养的细胞具有干细胞特性,是肝干细胞。2、观察倒千里光碱联合肝脏部分切除术(RS/PH)对肝损伤后再生修复的影响。本实验成功构建了倒千里光碱联合肝脏部分切除术导致肝脏急性损伤的大鼠模型,实验可见肝脏中毒及中毒后肝干细胞增殖的现象,术后H-E染色发现RS/PH组汇管区小胆管周围和肝小叶内可见成簇或散在分布的卵圆细胞增生,CK19、c-kit阳性细胞出现在汇管区,特别是小胆管周围,形态与周围胆管细胞相似。而PH组未见以上表现。证实该模型可抑制成熟肝细胞增殖,同时通过刺激肝卵圆干细胞增殖以实现修复。这为研究适用于肝干细胞移植的动物实验模型提供一些有价值的信息。3、肝干细胞移植的成功率低仍是目前国内外研究中亟待解决的一个问题。为了进一步提高肝干细胞在肝脏中的存活,本实验室完成脂质体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐(L-CL2MDP)的制备,通过腹腔注射L-CL2MDP,特异性的清除肝脏及脾脏中的巨噬细胞,并进一步联合应用我们已经构建的倒千里光碱/部分肝切的大鼠肝损伤模型,建立一种新的肝干细胞移植模型。目前,我们从本实验室已有荧光转基因小鼠肝脏分离肝脏干细胞,获得稳定表达GFP的细胞株,将GFP+-LSC细胞通过脾脏注射移植给L-CL2MDP/RS/PH处理的大鼠。观察其在肝内的增殖情况,并对对照组和处理组加以检测及比较,以确定此模型是否能够提高肝干细胞的移植效率。