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紫杉醇(Taxol)是临床应用的高效、低毒的抗癌药物。产紫杉醇内生真菌是获取紫杉醇的重要药源途径之一。目前,已有55个属200多株内生真菌被报道可产紫杉醇,但是真菌中紫杉醇产量低且不稳定,尚无一株可应用于产业化生产。基于真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,构建稳定高产的基因工程菌株是实现其产业化应用的主要途径之一。筛选真菌中紫杉醇生物合成相关基因,并验证其功能,是阐明真菌紫杉醇合成的分子机制以及构建高产工程菌株的关键。本研究分析了枝状枝孢霉(Cladosporium cladosporioides;简称:枝霉)MD2的转录组信息,初步推测了枝霉MD2的紫杉醇合成途径,获得49个与其紫杉醇合成相关的unigenes;克隆了两个候选基因A05868和A02976,分别对其进行了生物信息学分析,构建其过表达载体及转基因菌株,并分析了过表达这两个候选基因对枝霉MD2紫杉烷类合成的影响。主要研究成果如下:1)采用Illumina Hiseq?2500高通量测序技术对枝菌MD2的转录组进行测序并进行系统的生物信息学分析。Trinity de novo组装得到16603个unigenes,分别在NR、NT、PFAM、Swiss Prot、GO、KOG和KEGG数据库进行BLAST注释,共有12479个unigenes至少可在一个数据库进行注释,1593个unigenes可被七个数据库进行注释。8425个unigenes可进行GO功能注释,归属到生物过程、细胞成分和分子功能三大类共57个功能组。3350个unigenes可进行KEGG注释,归属到262个KEGG代谢途径。在此基础上,推测了枝霉MD2中潜在的紫杉醇生物合成途径及其基因信息,包括参与萜类骨架生物合成的9个unigenes和参与紫杉烷类生物合成的40个unigenes。2)克隆了候选基因A05868,该基因DNA和cDNA序列分别为1425 bp和1260 bp;其编码蛋白包含419个氨基酸,与Pseudocercospora fijiensis CIRAD86的溶血磷脂酸酰基转移酶吞蛋白(lysophosphatidic acid acyltransferase endophilin)有57%的一致性,C端有Bin Amphiphysin RVS(BAR)结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A05868并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A05868/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得8株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株(A05868/MD2-A8、B1、B6、C1)进行qRT-PCR分析,发现A05868/MD2-B6转基因菌株的候选基因的表达量最高,为对照(未转基因)菌株的3倍(5天);进一步提取该菌株的紫杉烷类并进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中未检测到紫杉醇、巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇和多烯紫杉醇4种紫杉烷类物质;而转基因菌株A05868/MD2-B6的10-去乙酰巴卡亭III产量(14.621±0.186μg/g)和10-去乙酰紫杉醇产量(1.564±1.025μg/g)相比对照菌株(18.321±0.045μg/g,3.213±0.063μg/g)分别下降了20.195%和51.323%,该结果初步说明过表达A05868对枝霉MD2的10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用。3)克隆了候选基因A02976,该基因DNA和cDNA序列分别为1685 bp和1518 bp;其编码蛋白包含505个氨基酸,与Fusarium oxysporum的单端孢霉烯3-O-乙酰转移酶(trichothecene 3-O-acetyltransferase)有43%的一致性,C端有转移酶结构域。进一步构建该基因的超表达载体pTFC-A02976并转化枝霉MD2,通过抗性筛选获得14株A02976/MD2转基因菌株。采用Southern blot检测各转基因菌株中目标基因的拷贝数,共获得10株外源基因以单拷贝方式插入的转基因菌株。选择其中4株(A02976/MD2-A6、A8、C1、D8)进行qRT-PCR分析,发现A02976/MD2-C1转基因菌株的候选基因的表达量最高,是对照菌株的A02976候选基因表达量的3.2倍(10天)。选择A02976/MD2-C1进行HPLC分析,发现在转基因菌株和对照菌株中均未检测到紫杉醇、巴卡亭III和多烯紫杉醇3种紫杉烷类物质。转基因A02976/MD2-C1中未检测到10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇,而对照菌株可检测到;转基因A02976/MD2-C1可以检测到7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇,其产量为4.253±0.017μg/g,但对照菌株未检测到该物质。该结果初步说明过表达A02976对枝霉MD2中10-去乙酰巴卡亭III和10-去乙酰紫杉醇的代谢合成有抑制作用,对7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇的合成有促进作用。