多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指在其碳骨架上含有一个以上双键的长链脂肪酸,主要分为ω-6和ω-3两个系列。花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)是其中的典型代表。ARA和EPA作为人体必须脂肪酸,在促进脑与神经发育、预防心血管疾病、调节炎症反应等生理活动方面具有重要作用,目前已经广泛应用于食品、医药保健品和化妆品等领域。ARA和EPA传统来源于动物肝脏和深海鱼油中提取,因提取成本高、产量不足而难以满足市场需求。产油微生物高山被孢霉(Mortierella alpina)中,ARA约占细胞总脂40%左右;在ω-3脱氢酶作用下,ARA会转化成EPA,同样具有生产EPA的潜力,因此通过对高山被孢霉的培养条件进行优化以及通过遗传改造等手段来提高ARA和EPA的含量逐渐成为研究热点。本文通过响应面优化培养基提高了 ARA产量,通过外源表达17des脱氢酶提高了 EPA产量,构建了 CRISPR/Cpf1敲除质粒,拟在高山被孢霉G12中建立基因编辑系统。本文首先以实验室筛选出的高山被孢霉G12为研究对象,通过响应面法优化高山被孢霉产ARA发酵培养基。在实验室前期研究和相关文献调研的基础上,使用Plackett-Burman法设计实验从初始培养基中筛选出三个影响ARA产量的主要因素:酵母粉、葡萄糖、玉米浆干粉,然后使用最陡爬坡法确定与ARA产量相关因素的最大响应值;最后用Box-Behnken法设计三因素三水平实验,通过结果分析与后续实验验证得到最优的培养基,其成分为:酵母粉12.6g/L,葡萄糖 75.6g/L,玉米浆干粉 7.1g/L,MgSO4 0.5g/L,KH2PO4 1g/L,CaCl2 0.5g/L,pH6.5。发酵7d,ARA产量达到5.12g/L,相比优化前提高了 27.3%。通过脂肪酸合成代谢通路可知,ARA在ω-3脂肪酸脱氢酶的作用下脱氢形成EPA,然而高山被孢霉ω-3脱氢酶仅在低温(18℃)下诱导表达且表达量有限。本文首先建立了根癌农杆菌C58C1介导的高山被孢霉G12遗传转化方法,构建了含有能在常温下表达的异枝水霉(Saprolegnia diclina)的ω-3型Δ17脱氢酶和萎锈灵抗性基因的双元载体pBIG-CBXB-17des,并成功转化高山被孢霉G12,经发酵验证EPA在总脂中含量可达到2.91%,产量达到0.47g/L。CRISPR/Cpfl是继ZFNs、TALENs后的第三代基因编辑技术,具有操作简便、编辑高效、通用性广等优点,为了研究脂肪酸代谢途径关键酶基因的功能,本文尝试在高山被孢霉G12中建立CRISPR/Cpfl基因编辑系统。以ura5为靶基因,设计sgRNA,构建了含有Cpfl基因和sgRNA的双元载体pBIG-sgRNA-nlsCpfl。试图通过农杆菌介导转化高山被孢霉G12,敲除ura5部分基因片段,得到ura5-营养缺陷型菌株。目前尚没有筛选到转化子,有待继续研究。