论文部分内容阅读
应力作用下牙槽骨的改建是口腔正畸牙齿移动的生物学基础。成骨细胞是牙槽骨改建中重要的效应细胞之一。成骨细胞的生物力学效应在骨形成与骨改建过程中至关重要。研究应力作用下成骨细胞的生物学特性及其信号转导机制对认识正畸治疗中牙槽骨改建的机理有重要意义。成骨细胞力学信号转导通路还不是十分清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)在调控细胞生长中有重要作用,应力可以激活骨骼肌m TOR信号,但是应力对成骨细胞m TOR信号作用的研究较少见,并且周期牵张应力是否可以通过激活m TOR信号调控成骨细胞的增殖、分化与能量代谢还不是很清楚。本研究通过对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),观察了应力对人成骨样细胞增殖、分化与能量代谢的影响,探讨了Akt/m TOR/p70s6k信号通路在其中的调控作用,并通过大鼠正畸牙齿移动实验观察牙齿移动过程中牙周膜细胞Akt/m TOR/p70s6k的表达情况,为进一步研究提供基础。实验一周期牵张应力对成骨样细胞增殖与分化的作用目的:研究周期牵张应力对成骨样细胞增殖与分化的影响。方法:对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),应用流式细胞术和ALP试剂盒检测成骨样细胞S期细胞比例与ALP活性的变化;应用实时定量PCR、细胞免疫荧光与western blot方法分析ALP、OCN、runx2、COLI及P4HB(脯氨酸羟化酶亚基)基因表达变化和ALP、runx2及P4HB蛋白表达变化;矿化培养第5周与第6周,用茜素红S染色观察矿化结节形成情况。结果:加载周期牵张应力24小时后,S期细胞比例与ALP活性明显增加(P<0.05),而对矿化培养的MG63细胞加载应力3天(每天加力8小时),S期细胞比例无明显变化,但ALP活性仍显著增加(P<0.05)。周期牵张应力可以上调ALP、OCN、runx2、COLI及P4HB基因表达(P<0.05),增加ALP、runx2及P4HB蛋白表达(P<0.05),促进矿化结节的生成。结论:在成骨细胞密度较低时,应力促进其增殖并上调成骨相关基因和蛋白,为随后的成骨分化在细胞数量和成骨分化因子浓度上做准备;当细胞数量和成骨分化因子达到一定水平后,应力不再对增殖起作用,转而促进成骨分化。实验二周期牵张应力对成骨样细胞能量代谢的影响目的:研究周期牵张应力对成骨样细胞能量代谢的影响。方法:对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),应用葡萄糖与乳酸试剂盒测定葡萄糖消耗与乳酸水平的变化;应用ATP检测试剂盒测定ATP水平的变化;应用实时定量PCR、细胞免疫荧光与western blot方法测定ATP合成酶(ATP5B、ATP5F1、ATP5J和F1-ATPaseα亚基)、烯醇化酶1(ENO1)和乳酸脱氢酶A(LDHA)基因表达变化及ATP5B和ATP5J蛋白表达变化。结果:周期牵张应力可以上调人成骨样细胞ATP5B、ATP5F1、ATP5J、F1-ATPaseα、ENO1与LDHA基因水平(P<0.05),可以增加人成骨样细胞葡萄糖消耗、乳酸水平及ATP浓度(P<0.05),同时可以增加ATP5B与ATP5J的蛋白表达(P<0.05)。结论:周期牵张应力可以通过控制能量代谢中的关键酶,促进人成骨样细胞MG63的能量代谢,为应力调控成骨细胞增殖与分化提供能量。实验三周期牵张应力对成骨样细胞Akt/m TOR/p70s6k信号通路的影响目的:研究周期牵张应力对成骨样细胞Akt/m TOR/p70s6k信号通路的影响。方法:对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),应用细胞免疫荧光与western blot方法测定Akt、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、m TOR、p-m TOR(Ser2448)、p70s6k及p-p70s6k(Thr389)蛋白表达变化。结果:周期牵张应力对Akt、m TOR及p70s6k蛋白表达无明显影响,但是可以上调p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、p-m TOR(Ser2448)及p-p70s6k(Thr389)磷酸化蛋白的水平(P<0.05)。结论:周期牵张应力可以激活成骨样细胞Akt/m TOR/p70s6k信号通路。实验四Akt/m TOR/p70s6k信号在应力调控成骨样细胞增殖与分化中的作用目的:研究Akt/m TOR/p70s6k信号在应力促进成骨样细胞增殖与分化中的作用。方法:对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),加力前加入m TOR抑制剂rapamycin、Akt抑制剂wortmannin和溶剂对照DMSO。应用实时定量PCR、细胞免疫荧光和western blot方法测定ALP、OCN、runx2、COLI及P4HB基因表达变化和ALP、runx2、P4HB、Akt、p-Akt(Thr308)、p-Akt(Ser473)、m TOR、p-m TOR(Ser2448)、p70s6k及p-p70s6k(Thr389)蛋白表达变化;应用流式细胞术和碱性磷酸酶试剂盒分析S期细胞比例与ALP活性变化;在矿化第6周应用茜素红S染色观察矿化结节形成情况。结果:Wortmannin能有效阻断周期牵张应力激活的Akt与m TOR信号(P<0.05),而rapamycin只能阻断应力激活的m TOR信号(P<0.05),对Akt信号无明显影响。应力促进S期细胞比例增加的趋势能被rapamycin和wortmannin抑制(P<0.05)。应力促进ALP、COLI、OCN、P4HB和runx2基因增加的趋势能被rapamycin抑制(P<0.05),但是除了ALP基因之外,其它基因在应力作用下的增加趋势不能被wortmannin抑制。同时,应力促进成骨样细胞runx2、ALP及P4HB蛋白表达、ALP活性和矿化结节生成的作用能被rapamycin抑制,而不能被wortmannin抑制。结论:周期牵张应力促进成骨样细胞增殖的作用依赖于Akt/m TOR/p70s6k信号通路;但是应力促进成骨样细胞分化的作用依赖于m TOR信号,而不依赖于Akt信号的激活。实验五Akt/m TOR/p70s6k信号在应力调控成骨样细胞能量代谢中的作用目的:研究Akt/m TOR/p70s6k信号在应力促进成骨样细胞能量代谢中的作用。方法:对人成骨样细胞MG63加载周期牵张应力(10%,0.1Hz),加力前加入m TOR抑制剂rapamycin、Akt抑制剂wortmannin和溶剂对照DMSO。应用葡萄糖与乳酸试剂盒测定葡萄糖消耗与乳酸水平;应用ATP检测试剂盒测定ATP水平的变化;应用实时定量PCR、细胞免疫荧光与western blot方法测定ATP5B、ATP5F1、ATP5J、F1-ATPaseα、ENO1和LDHA基因表达变化与ATP5B和ATP5J蛋白表达变化。结果:周期牵张应力增加葡萄糖消耗、乳酸水平、ATP浓度、ATP5B和ATP5J蛋白的趋势能被wortmannin和rapamycin抑制(P<0.05)。除了ENO1之外,应力促进ATP5B、ATP5F1、ATP5J、F1-ATPaseα与LDHA基因增加的趋势均能被wortmannin和rapamycin抑制(P<0.05)。结论:周期牵张应力可以通过激活Akt/m TOR/p70s6k信号通路而促进成骨细胞的能量代谢。实验六大鼠正畸牙齿移动对牙周膜细胞Akt/m TOR/p70s6k信号的影响目的:观察大鼠正畸牙齿移动对牙周膜细胞Akt/m TOR/p70s6k信号的影响。方法:15只SD大鼠(8周龄,体重227±3.4g)随机分为实验组(加力组)与对照组(不加力组)。实验组在右上第一磨牙与前牙之间用光固化树脂粘结镍钛拉簧,调整拉簧长度使之加力约30g。对照组(不加力组)进行相同的手术但不粘结拉簧。在加力的第0、1、3、9、15天处死大鼠,迅速分离右上磨牙、牙周膜及牙槽骨,固定、脱矿、脱水、石蜡包埋、切片、进行免疫组化染色,观察张力区与压力区牙周膜细胞Akt、m TOR及p70s6k蛋白的表达。结果:加力第3天右上第一与第二磨牙间开始出现间隙,第9天间隙更大(P<0.05),第15天间隙与第9天没有明显差异(P>0.05)。牙齿移动过程中,牙周膜细胞Akt、m TOR及p70s6k蛋白均随时间而增加。Akt蛋白在张力区第3天达到高峰,在压力区第9天达到高峰,之后有所下降,但仍高于对照组(P<0.05);m TOR及p70s6k蛋白在张力区与压力区均是第9天达到高峰,之后有所下降,但仍高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠正畸牙齿移动过程中,张应力区与压应力区牙周膜细胞Akt/m TOR/p70s6k表达均增加。