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目的:心肌干细胞再生疗法是心肌梗死的新型治疗方法,但是心肌干细胞数量少,扩增难度大,其体外培养方法并没有统一的标准,国内许多实验室获得的心肌干细胞未能实现其多向分化潜能的鉴定,从而尚不能作为心肌干细胞的有力佐证。本研究旨在探讨一种高效、稳定的小型猪心肌干细胞体外培养方法,并且对其进行全面系统的鉴定,为心肌梗死的细胞生物疗法奠定基础。方法:选取成年巴马小型猪,雌性,体重25-30kg。通过心脏外科手术经右侧第二肋间做小切口钳取右心耳组织,用组织块培养法获取原代心肌干细胞,以心肌干细胞培养液进行培养,视细胞生长情况进行传代。选取分选纯化后的第3代细胞行流式检测鉴定细胞表型:c-kit、CD34、CD45、CD31、CD90、Lineage;行Western Blot检测心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4的表达;经诱导剂诱导后行免疫荧光检测CX43、cTnT、α-SMA、vWF的表达以观察心肌干细胞的多向分化潜能。结果:1.从成年小型猪右心耳组织中分离的原代细胞于倒置显微镜下观察呈“小、圆、亮”的特征,生长缓慢,传代后细胞贴壁生长,形态逐渐变成梭形,较原代易于生长。2.纯化后细胞经流式细胞仪鉴定细胞表型为c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-。3.Western Blot检测结果示心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4表达阳性。4.纯化后细胞经不同诱导剂诱导培养后,能够表达:心肌细胞特异性蛋白CX43和cTnT,平滑肌细胞特异性蛋白α-SMA,以及内皮细胞特异性蛋白v WF。结论:1.自成年小型猪右心耳组织成功分离获得细胞表型为c-kit+CD34-CD45-CD31-CD90-Lineage-的细胞,阳性表达干细胞表面标记物。2.本研究获得的细胞能够表达心肌早期特异性转录因子Nkx2.5和GATA-4,提示该细胞具备调控自身向心肌细胞早期分化的能力。3.经诱导剂诱导培养后细胞能够表达CX43、cTnT、α-SMA、v WF等特异性标记蛋白,提示该细胞具有向心肌细胞、平滑肌细胞及内皮细胞等多方向分化的潜能。4.本研究自原代组织块中分离、培养、纯化所得细胞经流式细胞仪、Western Blot测定、多向分化潜能检验等过程鉴定为心肌干细胞。本研究探索出一种高效、统一的小型猪心肌干细胞体外培养及鉴定方法,对于临床治疗具有指导意义。