研究背景及目的皮肤老化表现为皱纹形成、色沉增多、弹性下降等,受内源性因素和外源性因素的共同影响[1]。内源性因素导致的皮肤老化又称为自然老化,由遗传和不可抗力(如内分泌变化、免疫功能的下降等)导致,是机体自然衰老的体现之一,目前尚不可人为调控。造成皮肤老化的外源性因素有很多,如紫外线辐射、吸烟、不健康饮食、空气污染、睡眠质量差、化学物质刺激等,这些因素是可以人为控制的[2]。虽然相关机制尚未研究透彻,但目前研究已经证明,紫外线辐射是导致皮肤老化的主要因素,某种角度上来讲光老化即外源性老化的代称[3-5]。有关光老化机制及干预手段的研究一直是皮肤科领域的热点。A型肉毒素(Botilium Toxin Type A,BoNTA)是肉毒杆菌分泌的七种神经毒素中最有效的一种,在临床得到广泛应用[6]。BoNTA可引起肌肉松弛,由于它这种肌肉松弛的特性可以使皱纹(主要是动态性皱纹)得到改善,现已成为皮肤科治疗外源性老化的重要手段之一[7.8]。2005年和2008年,一些研究人员发现在颜面的中下1/3处皮下注射BoNTA,可一定程度地提升面部曲线[9,10]。为了解BoNTA在改善皮肤状态中的真实效用,2012年,Sang-Ha Oh等研究了BoNTA对离体状态下对正常人真皮成纤维细胞(Human dermal fibrolasts,HDFs)的影响,得出BoNTA具有显著的提高胶原蛋白产生水平、降低其降解作用的结论[12]。2014年,本研究小组对于UVB所致光老化的HDFs进行了体外研究,得出了 BoNTA可以有效提高COL-Ⅰ及COL-Ⅲ水平,减少MMP-1及MMP-9分泌的结论[13]。2016年,朱洁等证明了局部应用BoNTA可以增强二氧化碳(cnarbon dioxide,CO2)点阵激光术后的复原效果,进一步表明BoNTA可以改善皮肤质地,使皮肤变得更光滑[14]。这些研究不仅证明了 BoNTA对HDFs在改善皮肤状态上的积极作用,而且也暗示了 HDFs的重要性。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度大于200个核苷酸片段、不具有编码蛋白质的功能[15]。随着基因检测技术的进步和相关知识不断深入,以前被认为是转录“噪声”的LncRNA现在被证明具有一定的功能,lncRNA可通过调节基因组印记、染色体修饰、核转运、转录激活、干扰等来参与生物学过程[16,17]。在生理条件下对细胞功能的理解如果忽略了对lncRNAs所发挥的作用的分析,是不全面的。因此,我们将从研究UVB辐射对正常HDFs、BoNTA对正常HDFs及BoNTA对UVB诱导的提前衰老(UVB induced premature senescence,UVB-IPS)HDFs 中 lnc-RNA 表达的影响着手,研究原来被认为没有功能的lncRNA在光老化发生和BoNTA改善皮肤老化中的可能机制及作用环节。研究方法1.各部分实验的分组从包皮环切术后的皮肤分离培养的人真皮成纤维细胞(Human dermal fibrolasts,HDFs),选处于对数生长期8-11代的正常HDFs,分别分组如下:(1)第一部分:①对照组;②UVB诱导提前衰老成纤维细胞(UVB-IPS)组:UVB以10mJ/cm大小能量连续照射5天,静置3天。用β-半乳糖苷酶验证两组细胞的衰老状况。(2)第二部分:①对照组;②BoNTA处理组(2.5U48h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理组(5U 48h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;④BoNTA处理组(7.5U48h):BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理组(5U24h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理组(5U 72h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与HDFs共孵育时间为72h(3)第三部分:①对照组;②BoNTA处理UVB-IPS组(2.5U 48h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;③BoNTA处理UVB-IPS组(5U 48h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与UVB-IPS的 HDFs 共孵育时间为 48h;④BoNTA 处理 UVB-IPS 组(7.5U 48h):BoNTA的处理剂量为7.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为48h;⑤BoNTA处理UVB-IPS组(5U24h):BoNTA的处理剂量为2.5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为24h;⑥BoNTA处理UVB-IPS组(5U 72h):BoNTA的处理剂量为5U/106细胞,与UVB-IPS的HDFs共孵育时间为72h。2.RNA芯片筛选差异表达的RNA(lncRNA和mRNA)及生物信息学分析使用TRIzol提取各组HDFs的总RNAs,进行RNA芯片分析。以归一化强度的|log2(Ratio)| ≥2 为条件筛选UVB-IPS 的 HDFs,BoNTA(5U 48h)处理的HDFs和BoNTA(48h 5U)处理UVB-SIPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA,并对所得差异RNA的靶基因进行GO分析以及pathway富集分析。使用 qRT-PCR(Quantitative real time PCR,实时定量 PCR)法验证 UVBvs 对照组、BoNTA(5U 48h)vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组按照设定原则筛选的 lncRNA 和 mRNA。3、qRT-PCR法进一步验证筛选出来的lncRNA和mRNA利用qRT-PCR法对筛选出来的各造模组中均差异表达的RNA(FGFR3P,COL19A1)进行进一步验证:即检测在BoNTA(5U 48h)vs对照组、BoNTA处理UVB-IPSvs对照组中FGFR3P和COL19A1表达水平随BoNTA剂量、时间不同发生的变化。结果1.UVB诱导提前衰老HDFs中lncRNA的筛选及初步分析:(1)以亚毒性计量的UVB(10mJ/cm2)多次(5次)照射HDFs后,β-半乳糖苷酶阳性率显著高于未照光组(P<0.05)。(2)利用差异倍数Fold change值进行筛选,设定差异倍数(Fold change,FC)值≥时与对照组相比较,UVB诱导光老化HDFs中检测出差异表达的lncRNA和mRNA数分别为3224和1630个:生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与光老化有关,如:细胞对UVB的反应、自噬、细胞凋亡等。(3)选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与RNA芯片分析结果趋势一致,证明芯片分析结果的可靠性。2.A型肉毒毒素处理后人真皮成纤维细胞长链非编码RNA表达谱的筛选及初步分析:(1)与对照组相比较,BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后,设定FC≥2时,HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为2124和638个。(2)生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与皮肤老化有关,如:胶原蛋白的产生、细胞增殖等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;筛选出来FGFR3P和COL19A1的qRT-PCR验证结果说明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控有一定的时间及剂量相关性。3.A型肉毒毒素处理对UVB-IPS的HDFs中lncRNA表达谱的影响:(1)与对照组相比较,BoNTA以5U/106细胞的剂量孵育48h后,设定FC≥2时,UVB-IPS的HDFs中差异表达的lncRNA和mRNA数分别为1651和1221个。(2)生物信息学分析提示,差异表达的lncRNA涉及多种生物学功能,部分生物学功能与皮肤老化有关,如:如有丝分裂细胞周期G1/S间转换、成纤维细胞增殖、胶原蛋白产生、细胞老化等。(3)初步选择出来RNAs的qRT-PCR的结果与芯片分析结果趋势一致;进一步的qRT-PCR验证结果表明BoNTA对FGFR3P和COL19A1表达的调控与处理时间和剂量相关。结论UVB和BoNTA可以显著改变HDFs中lncRNAs和mRNAs的表达水平,BoNTA亦可通过作用于UVB-IPS的HDFs而引起lncRNAs表达的变化;这些与包括皮肤老化在内的多种生物学行为有关。