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微小RNA (miRNA, microRNA)是一类长度为19-25个核苷酸、内源性、非编码的单链小分子RNA,通过与靶基因序列互补配对的方式调控靶基因的表达。除了通过翻译抑制、切割等方式负调控靶基因mRNA的表达外,还可以通过miRNA激活等对靶基因进行正调控。miRNA广泛存在于动物、植物、微生物和病毒等有机体中,参与了生物体的生长、发育、分化、细胞凋亡和信号传导等多个生物学过程。桑树(Morus L.)是一种落叶乔木,除了用于栽桑养蚕外,还具有重要的经济和生态价值。随着桑树基因组高通量测序的完成和小RNA文库的建立,为桑树miRNA的研究提供了平台。目前,对于桑树抗逆性、独特药用价值、与家蚕间关系等方面的研究已有报道,但是关于miRNA与功能基因之间的调控关系方面的研究甚少。基于川桑小RNA文库,从中分析得到一个新miRNA (miRn51)。完成了其前体二级结构的预测、上游启动子序列以及靶基因预测等信息学分析。分别从川桑基因组和cDNA中克隆到该miRNA的前体和成熟体序列。在此基础上利用qRT-PCR和miRNA 5’-RACE方法验证了miRn51切割MnPPO2基因的精确位点。以生长2个月的粤桑(69851)幼苗为材料,对其进行非生物胁迫(高温、干旱、高盐)和信号分子处理(ABA、SA、H2O2和MeJA),通过qRT-PCR方法分析胁迫下miRn51和靶基因的表达情况。最后利用农杆菌介导的外源基因瞬时表达技术,对桑树miRn51与其靶基因的调控关系进行验证。本研究的主要研究结果如下所示：1、川桑miRn51序列及靶基因生物信息学分析基于川桑根、雄花和叶3个组织小RNA Illumina HiSeq-2000测序数据,获得85个桑树保守miRNA分子和262个组织特异的miRNA分子。依据其表达量和靶基因注释信息筛选出10个候选miRNA进行初步分析,最后根据研究兴趣选择在桑树中首次发现的miRn51为研究对象进行深入分析。发现miRn51具有典型植物miRNA前体二级结构特征。启动子预测发现除了具有转录起始功能的CAAT-box和TATA-box等结构域外,还包含多个胁迫响应元件,如：干旱应答(MBS)、病原菌响应(TC-repeat)和抗氧化响应(ARE)等。运用生物信息学方法预测miRn51潜在靶基因有8个,均为多酚氧化酶基因家族,其中miRn51与7个靶基因调控方式为切割,1个为翻译抑制。从川桑基因组中克隆了miRn51的前体序列的87个核苷酸,利用茎环PCR方法得到全长为71 bp的产物,说明pre-miRn51能够加工为成熟miRn51。2、川桑miRn51靶基因验证及胁迫诱导表达分析利用qRT-PCR方法对桑树miRn51和其中的7个潜在靶基因在川桑五个组织中的表达谱进行分析。结果表明这些miRNA与靶基因的组织表达模式差异很大,其中Morus012130在花中特异表达,Morus012131在果实中表达量最高,Morus012128则在皮中表达量最高。说明同一个家族基因不同基因在同一植物中不同组织间表达量是不尽相同的,暗示这些基因在不同组织中所起的功能存在着差异。值得注意的是Morus01212、Morus012122和Morus012124在根和皮中表达非常低,但却在雄花、叶和果实中有较高的表达,与miRn51在相同组织中表达模式呈相反趋势,这与mRNA与靶基因间的调控方式是一致的。推测miRn51可能调控的靶基因为Morus012121、Morus012122和Morus012124.通过比对发现Morus012124编码的蛋白为多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO2)。经miRNA 5’-RACE分析,miRn51切割靶基因精确位点分别在miRNA 5’端第10-11、7-8个碱基的位置,切割频率为分别为18/20和2/20。以生长2个月大的粤桑(69851)幼苗为材料,分别进行高温、干旱、低温、ABA、SA、H2O2和MeJA处理,检测miRn51与MnPP02在受到胁迫处理时表达情况。结果表明,miRn51和MnPP02基因在不同胁迫处理时表现出不同的表达模式。3、农杆菌介导的瞬时转化体系的建立及miRn51与MnPP02表达分析构建PLGNL-35S-miRn51植物超量表达载体,利用农杆菌介导浸染桑树叶片从而形成瞬时表达体系。通过GUS组织化学染色、多酚氧化酶活性检测以及荧光定量PCR等方法,分析不同缓冲液成分、农杆菌浸染菌液浓度、转化后时间以及不同桑树品种等试验条件对转化效果的影响。结果表明,1号缓冲液、农杆菌菌液浓度OD600=0.6转染桑树叶片3天时,瞬时转化体系是最优的。在此基础上探讨桑树miRn51与MnPP02调控关系。