论文部分内容阅读
目的:代谢综合征是（MS）由多系统代谢紊乱引起的一组慢性疾病综合征,包括肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病（T2DM）、心血管疾病和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）,已经成为危害全世界人类健康的严重问题。MS的特征是胰岛素抵抗和持续存在的慢性低丰度性代谢性炎症。脂肪组织被认为是代谢性炎症的主要来源,而前脂肪细胞的数量占脂肪组织细胞的15-50%。近期研究还提示:在脂肪组织中募集巨噬细胞及促使促炎因子分泌的主要贡献者并不是成熟的脂肪细胞,而是未分化的前脂肪细胞。CD36是一种调节多种免疫和代谢功能的清道夫受体,与MS的发生发展密切相关。因此,本研究拟观察前脂肪细胞CD36在代谢性炎症及MS中的作用,并初步探讨其分子机制。方法:第一部分:人群健康调查数据来自于重庆医科大学第一附属医院和金山分院门诊体检进行健康体检的28035名患者:首先根据患者血清hs-CRP值对患者进行四分位数分组,分析不同程度炎症状态下血压、血糖、血脂、肝功能的变化情况。然后,再根据体重系数、腰围对患者进行四分位数分组,分析不同肥胖程度下患者的炎症水平。人脂肪组织样品来自于重医科大学第二附属医院接受腹部手术的患者:根据是否患有MS,分为正常对照（normal）组代谢综合征（MS）组。HE染色分析人脂肪组织病理改变,免疫组化染色测定人脂肪组织CD36、F4/80的蛋白表达,CD36和Pref-1的双重染色分析CD36在人前脂肪细胞上的定位。第二部分:将6周龄C57BL/6J小鼠随机分为C57BL/6J普通饮食组（CTL,n=8）和C57BL/6J高脂饮食组（HFD,n=8）。将6周龄野生型小鼠（WT-HFD,n=8）和CD36基因敲除小鼠（CD36KO-HFD,n=8）进行高脂饮食喂养。所有小鼠喂养14周,在喂养结束前一周做糖耐量试验和胰岛素抵抗试验。喂养结束后,称量体重和收集附睾脂肪组织样本。CD36和Pref-1的双重染色分析CD36在人前脂肪细胞上的定位,HE染色分析鼠脂肪组织病理改变;免疫组化染色测定鼠脂肪组织F4/80的蛋白表达。第三部分:FFA处理3T3-L1前脂肪细胞后,Western blot和单标流式检测CD36蛋白水平。转染慢病毒载体以建立CD36超表达的3T3-L1前脂肪细胞稳定细胞系。油红O和Bodipy染色分析细胞内脂质聚积情况;提取细胞蛋白,采用Western blot检测细胞CD36、ACC、PACC、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1蛋白表达水平;提取细胞RNA,采用QPCR检测前脂肪细胞炎症/趋化因子mRNA表达水平;运用Transwell细胞迁移实验检测前脂肪细胞CD36超表达对THP-1细胞迁移的影响。第四部分:MitoSOX染色测定3T3-L1前脂肪细胞线粒体活性氧（mtROS）水平以评价线粒体氧化应激,JC-1染色测定3T3-L1前脂肪细胞线粒体膜电位（MMP）评价线粒体功能。Fluo-4/AM染色观察胞内Ca2+含量,Fluo-4/AM与mitotracker共染分析线粒体内钙水平。使用2APB抑制IP3R介导的内质网向线粒体释放钙后,采用QPCR检测前脂肪细胞炎症/趋化因子mRNA的表达,应用Bodipy染色分析细胞内脂质沉积。结果:第一部分:健康调查数据显示无菌性炎症与多种代谢疾病呈正相关,BMI和腰围与无菌性炎症呈正相关（P<0.05）。对于脂肪组织染色结果显示,与正常患者相比,来自MS患者的脂肪组织中CD36蛋白和F4/80蛋白表达增加,且CD36和Pref-1的共定位效率更高,表明MS患者的前脂肪细胞CD36表达增加（P<0.05）。第二部分:与CTL组相比,HFD喂养的C57BL/6J小鼠具有肥胖、脂肪肝、糖耐量异常与胰岛素抗性（P>0.05）。F4/80染色显示HFD喂养诱导脂肪组织巨噬细胞浸润增多、诱发脂肪组织炎症（P<0.05）。CD36和Pref-1的共定位分析表明:在HFD诱导的MS小鼠模型上前脂肪细胞CD36的表达被上调（P<0.05）。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示CD36KO鼠模型构建成功。与WT-HFD相比,CD36KO并没有减轻小鼠的体重与脂肪重（P>0.05）;但是却缓解了HFD诱导的糖耐量异常与胰岛素抵抗（P<0.05）,同时CD36KO还保护小鼠免受HFD诱导的脂肪组织巨噬细胞浸润（P<0.05）。第三部分:Western blot结果显示:FFA时间依赖性地增加3T3-L1前脂肪细胞中的CD36表达（P<0.05）。CD36-PE单标流式也表明FFA诱导3T3-L1前脂肪细胞CD36在膜上定位增加（P<0.05）。用表达CD36的慢病毒载体转染3T3-L1前脂肪细胞,CD36超表达增加FA的吸收,促进脂质合成,抑制lipophagy,促进前脂肪细胞内脂质积聚（P<0.05）。CD36超表达还通过激活NF-κB p65和NLRP3炎性体介导炎症反应（P<0.05）。第四部分:JC-1与MitoSOX染色结果显示:与NC相比,CD36超表达降低MMP、促进mtROS的产生,提示CD36超表达介导线粒体功能障碍（P<0.05）。细胞内Ca2+含量与分布实验发现,CD36超表达增加细胞总Ca2+和线粒体内Ca2+水平（P<0.05）。用IP3R抑制剂2APB处理3T3-L1前脂肪细胞,抑制内质网向线粒体释放钙,可以保护细胞免受CD36超表达诱导的线粒体功能紊乱,并减轻炎症反应和脂质积聚,提示前脂肪细胞CD36通过IP3R介导的内质网向线粒体的钙转运,引起线粒体钙超载并诱导炎症反应（P<0.05）。结论:体内实验,在代谢综合征（MS）患者或高脂诱导的MS小鼠模型中前脂肪细胞CD36表达增加伴脂肪组织巨噬细胞浸润增多;CD36基因缺失可以减轻高脂诱导的胰岛素抵抗和脂肪组织巨噬细胞浸润。体外实验,游离脂肪酸可以诱导CD36在前脂肪细胞中的表达;同时前脂肪细胞CD36超表达后,可以通过增加IP3R介导的内质网向线粒体的钙转运引发线粒体钙超载,后者诱导线粒体功能障碍和mtROS的产生,进而促进NLRP3炎性体活化,从而诱导前脂肪细胞炎症反应和募集巨噬细胞,参与脂肪组织代谢性炎症的发生。