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Toll样受体3(Toll-like receptor3 TLR3)是Toll样受体家族的重要成员，特异性识别病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns PAMPs)，启动干扰素调节因子(interferon regulatory factor IRF)信号途径，通过IRF3和IRF7信号诱导I型干扰素的产生，从而诱导宿主的天然免疫应答。 本论文克隆获得大菱鲆(scophthalmus maximus)TLR3基因全序列并对其进行了生物信息学分析;研究了大菱鲆TLR3基因的组织表达差异;分别以Poly(I∶C)、肽聚糖、脂多糖LPS刺激大菱鲆后，研究其外周血白细胞(PBLs)中TLR3基因表达的变化情况;分别以Poly(I∶C)、肽聚糖、LPS、海豚链球菌(Streptococcus.Iniae)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella.tarda)和牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus viru，HRV)刺激或感染大菱鲆后，TLR3基因在肝脏、脾脏、鳃和头肾四种组织中的表达变化;通过构建原核表达载体pET-32a-TLR3，重组表达TLR3蛋白，并制备出多克隆抗体，应用多抗鉴定出大菱鲆四种组织中的TLR3蛋白;通过原位杂交技术对该基因进行了组织定位。具体研究结果如下: 利用斑马鱼(Danio rerio)、河豚(Takifugu rubripes)、斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）和牙鲆(Paralichthys olivaceus)的TLR3基因序列设计简并引物克隆得到大菱鲆TLR3基因序列全长为3100bp左右，其中包括编码961个氨基酸的2883 bp的开放阅读框;同源比对显示，所得到的氨基酸序列与牙鲆中的TLR3基因所编码的氨基酸序列相似度最高，最大识别度是79％;与鲈鱼的最大识别度是70％;与大黄鱼的最大识别度为66％;大菱鲆TLR3基因的预测蛋白结构具有TLR家族的典型特征，该基因为单次跨膜受体，N端具有38个氨基酸的信号肽，成熟肽则具有不保守的胞外结构:18个富含亮氨酸的重复序列(Leucine-rich Repeat LRR)、1个位于C端的富含亮氨酸的重复结构(LRR-CT)、1个跨膜结构域和1个胞内TIR结构域(IL-R1 homologous region);建立大菱鲆TLR3基因的Swiss-Model模型，分析结果显示该蛋白与鼠TLR3胞外区及结合了双链RNA后的鼠TLR3胞外区最为相似，序列一致性都为30.19％;大菱鲆TLR3氨基酸序列中包含39个磷酸化位点、16个N-糖基化位点。 通过半定量RT-PCR进行的组织表达分析显示，TLR3在健康大菱鲆的组织中具有较广的表达分布，其中在PBL、肝脏中的表达水平最高，鳃、脾、皮肤、肠中有较大表达量，前肾、心脏、肌肉、胃等也有表达;通过原位杂交技术检测到在鳃中，TLR3多分布于鳃丝和鳃小片的上皮细胞和支持细胞中;在皮肤中，TLR3分布于上皮细胞中，基膜及其以下的结缔组织和肌肉中未见分布;在肾脏中，TLR3分布于肾小管的上皮细胞中，其余结构中未见分布;在肝脏中，肝细胞处可见阳性信号，但认为由非特异性杂交造成;在脾脏中，阳性信号多而密集，但不排除有假阳性的可能;在胃中，TLR3分布于胃上皮细胞和固有膜中，肌肉层和外膜未见分布;在肠中，TLR3分布于小肠绒毛上皮细胞和固有膜中，肌肉层和外膜未见分布。以上研究结果表明，TLR3多分布于与外界环境直接接触的组织和细胞中，与免疫相关的组织中分布最多。 通过实时荧光定量PCR技术研究了Poly(I∶C)、肽聚糖、LPS三种配体刺激后大菱鲆PBLs中TLR3基因的相对表达量在12h内的表达变化情况，结果显示poly(I∶C)在12h时的TLR3相对表达量有显著的增加且明显高于其他组，验证了poly(I∶C)作为双链RNA的类似物是TLR3基因的特异性配体;在Poly(I∶C)、肽聚糖、LPS三种配体刺激后TLR3在肝脏、前肾、脾脏和鳃中的表达趋势都是遵循先升高后降低的规律，而从表达量方面看，poly(I∶C)作为TLR3基因的特异性配体在刺激后的表达量明显高于LPS和肽聚糖;海豚链球菌(S.Iniae)、迟缓爱德华氏菌(E.tarda）和牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus viru，HRV)三种病原感染后TLR3的表达趋势都是遵循先升高后降低的规律，而从表达量方面看，感染后头肾和肝脏中TLR3的表达量明显高于脾脏和鳃组织。在鳃和头肾中，牙鲆弹状病毒作为RNA病毒对TLR3基因的表达量变化的影响明显高于海豚链球菌和爱德华氏菌感染后的影响，而且在感染后第3天处达到了表达量最高峰，是对照组的4.7倍。在两种细菌感染的实验中，四种组织的TLR3基因表达量对于革兰氏阳性海豚链球菌和革兰氏阴性菌迟缓爱德华氏菌都有上调的现象，在脾脏中海豚链球菌的相对表达量略高于迟缓爱德华氏菌;在头肾中迟缓爱德华氏菌的相对表达量略高于海豚链球菌;而在鳃和肝脏中，两者的影响差别不大。 本论文成功构建了原核表达载体pET-32a-TLR3，诱导表达得到TLR3重组蛋白，分子量为35kDa，通过His标签亲和层析纯化重组蛋白作为抗原，注射免疫小鼠获得鼠抗大菱鲆TLR3抗血清，通过ELISA检测多克隆抗体效价为104，通过SDS-PAGE、Western检测结果显示所制备的抗血清可以与重组蛋白发生特异性结合在35kDa处有明显的条带，同样利用多抗与肝脏、脾脏、鳃和前肾四种组织中的蛋白结合，在40kDa、90kDa、120kDa处分别有特异性结合条带出现，证明了大菱鲆四种组织中TLR3蛋白的存在。 以上研究结果表明，所得到的大菱鲆TLR3基因是硬骨鱼类Toll样受体家族的重要成员，能够特异性的识别RNA病毒以及poly(I∶C)，在对抗其他配体及病原的侵染过程中也起到重要的作用;制备得到的TLR3多克隆抗体为大菱鲆TOLL样受体在蛋白水平上的研究提供了理论基础，为探讨识别并结合特异性配体后Toll样受体蛋白的免疫学特性及信号通路的相关研究提供了实验依据，并且丰富了鱼类关于天然免疫的研究内容。