【研究背景及目的】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是临床上常见的恶性程度较高的肿瘤，而我国是其高发区。近年来，HCC的诊断治疗上取得许多进展，但由于其早期不易发现，进展迅速，复发率高等特点，HCC死亡率仍较高，预后较差。对于不能手术切除的HCC患者，临床上也缺乏有效的治疗手段。因此，寻找新的早期诊断和治疗HCC的方法迫在眉睫。微小RNA（microRNA，miRNA）在细胞的分化、增殖、凋亡、细胞周期调控等许多生理过程中发挥重要作用，其异常表达亦与许多肿瘤的发生发展密切相关。miR-370位于人类14号染色体长臂上的DLK1-DIO3印记基因区域，在许多恶性肿瘤如膀胱癌、神经母细胞瘤、急性髓细胞白血病，口腔鳞状上皮细胞癌中表达下调。在胆管细胞癌中，miR-370通过下调癌基因丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶8（mitogen-activated protein kinase kinase kinase8，MAP3K8）的表达来抑制肿瘤细胞的增殖。在急性髓细胞白血病细胞中上调miR-370表达后，其靶基因叉头盒转录因子M1（Forkhed box M1，FoxM1）的表达下调，并显著抑制肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力。miR-370在口腔鳞状上皮细胞癌中通过下调胰岛素受体底物1（insulinreceptor substratre-1，IRS-1）的表达而显著抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。然而，miR-370在肿瘤中的作用尚有争议。有研究表明miR-370在胃癌、前列腺癌中表达升高，上调miR-370表达可促进肿瘤进展。以上研究表明miR-370对不同肿瘤细胞存在不同作用，而miR-370在HCC中的作用尚未见报道。本课题旨在观察miR-370对肝癌细胞生物学特性的影响，分析其与肝癌患者临床恶性表型和预后的相关性，探讨miR-370在肝癌中的作用，为肝癌治疗提供新的靶点。【实验方法】一、 miR-370在肝癌组织中的表达（一）比较人肝细胞株和人肝肿瘤细胞株中miR-370的差异表达培养人永生化肝细胞株（human nontransformed immortalized hepatocytes, IMH）及人肝肿瘤细胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC-LM3、PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H、SMMC-7721、QGY-7703、Focus、SK-Hep-1。抽取细胞总RNA，real-timePCR法检测miR-370的表达情况。（二）检测DEN模型大鼠肝脏组织中miR-370表达腹腔注射二乙基亚硝胺（diethylinitrosamine，DEN），按70mg/kg剂量腹腔注射，每周注射1次，连续注射10w，制备DEN诱导的大鼠肝癌模型。分别取正常、DEN开始注射后10W、18W、22W的大鼠肝组织，real-time PCR法检测miR-370表达。（三）比较人肝癌组织及癌旁组织中miR-370的差异表达收集20对人肝癌组织及相应的癌旁组织，抽取总RNA，real-time PCR法检测miR-370的表达情况。二、 miR-370对人肝癌细胞的生物学作用（一）miR-370对肝癌细胞增殖能力影响利用化学合成的miR-370拟似物（miR-370mimic）上调肝癌细胞株MHCC-97H、YY-8103、PLC/PRF/5中miR-370的表达，或利用2′-甲氧修饰的miR-370互补链（miR-370inhibitor）抑制其在肝癌细胞MHCC-97H、PLC/PRF/5中的作用，用Cellcounting kit8（CCK8）试剂检测细胞活性，记录450nm波长时的光密度值（OD），5天后分析细胞生长情况并绘制生长曲线。（二）miR-370对肝癌细胞克隆形成能力影响种植于24孔板的肝癌细胞株PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H分别转染pcDNA-miR-370和对照质粒pcDNA3.0，24小时后分至10cm细胞培养皿（PLC/PRF/5、MHCC-97H3000个细胞/皿，YY-81031000个细胞/皿），培养至克隆可见时（约2周后）用考马斯亮蓝染色2h，置于显微镜下拍照分析。三、miR-370的表达与肝癌患者临床恶性表型和预后的关系（一）比较人正常肝组织、肝癌组织及癌旁组织中miR-370的差异表达收集24例正常人肝组织、86对肝癌标本及相应的癌旁组织标本，Ambion试剂盒抽提总RNA，real-time PCR检测miR-370表达情况。（二）miR-370表达与肝癌临床恶性表型的相关性按miR-370表达的中位数将上述86对HCC标本分为miR-370高表达组和miR-370低表达组。分析miR-370表达与甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）、肿瘤分化程度、肿瘤大小、肿瘤个数、TNM分期、是否侵犯血管、有无卫星灶和包膜等临床特征的相关性。（三）利用组织芯片分析miR-370与肝癌患者生存期的相关性利用原位杂交技术检测包含50对人肝癌组织及癌旁组织的组织芯片中miR-370的表达情况。按肝癌组织中miR-370表达的中位数将50个HCC病人分为miR-370高表达组和miR-370低表达组。利用Kaplan-Meier生存分析法分析miR-370表达高低与HCC病人生存期长短的相关性。四、统计学处理数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。方差齐性两样本资料采用两样本双尾T检验；方差不齐的不配对资料采用Mann-Whitney U检验；四格表资料采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier分析；生存曲线采用log-rank检验；P<0.05为差异有统计学意义。【实验结果】一、 miR-370在肝肿瘤细胞株及肝癌组织中表达显著下降（一）肝肿瘤细胞株中miR-370表达显著下调Real-time PCR结果显示与人肝细胞株（IMH）相比，miR-370在肝肿瘤细胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC-LM3、PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H、SMMC-7721、QGY-7703、Focus、SK-Hep-1中表达均显著下调（P<0.05）。（二）DEN大鼠模型肝组织中miR-370表达显著下调Real-time PCR结果显示与正常大鼠肝组织相比，miR-370在DEN大鼠模型肝组织中表达显著下调。比较5对DEN大鼠肝癌组织与癌旁组织miR-370表达，结果显示80%（4/5）的肝癌组织较癌旁组织中miR-370表达显著下调（P<0.05）。（三）人肝癌标本中miR-370表达显著下调Real-time PCR结果显示miR-370在90%（18/20）的肝癌标本中表达下调，其中80%（16/20）下调超过50%（肝癌组织/癌旁组织<50%）。二、 miR-370抑制肝癌细胞恶性生物学行为（一）miR-370抑制肝癌细胞增殖能力miR-370mimic可显著抑制肝癌细胞株MHCC-97H、YY-8103、PLC/PRF/5的增殖能力。反之，miR-370inhibitor可显著促进MHCC-97H和PLC/PRF/5的增殖能力。（二）miR-370抑制肝癌细胞克隆形成能力克隆形成实验结果显示上调miR-370表达可显著抑制PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H细胞的克隆形成能力，抑制率分别为55%（P=0.004）、33.0%（P=0.036）、62.7%（P=0.004）。三、miR-370的表达与肝癌患者临床恶性表型和预后密切相关（一）正常肝组织、癌旁组织和肝癌组织中miR-370表达逐渐降低Real-time PCR结果显示与人正常肝组织相比，miR-370在癌旁组织中表达显著下调，并在肝癌组织中进一步下调。在检测的86对肝癌组织和癌旁组织中，56%（48/86）的HCC组织miR-370表达较癌旁组织显著下调，24%（20/86）无明显差异，20%（18/86）表达升高。（二）miR-370低表达与肝癌临床恶性表型密切相关通过对86对HCC标本临床资料的分析，我们发现miR-370表达与肿瘤大小、TNM分期、是否侵犯血管、肿瘤是否有微卫星灶和包膜等肝癌进展性临床相关指标密切相关。（三）miR-370低表达与肝癌总体生存期密切相关Kaplan-Meier生存分析结果显示，miR-370低表达的HCC患者总体生存期较短，miR-370高表达者总体生存期较长。【结论】1. miR-370在肝肿瘤细胞株、大鼠DEN模型肝组织和人肝癌标本中表达下降。2. miR-370抑制肝癌细胞增殖和克隆形成能力。3. miR-370在肝癌组织中的低表达与肝癌患者临床恶性表型和预后密切相关。