【摘 要】
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研究背景:Kv2.1类属电压门控钾通道,是目前所知的唯一位于细胞膜上的内质网-质膜接触点（ER-PM junction）链接蛋白。生理条件下,Kv2.1呈自由分散型和微米簇两种定位特征,前者通过电压依赖的K+电流调节细胞的基础电生理活动,后者与胞浆内质网上的蛋白形成稳定的膜接触位点并失去了电导功能。VAPA作为一种支架蛋白,通过自身的特殊位点与Kv2.1通道的非典型FFAT基序结合,共同构成ER-
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研究背景:Kv2.1类属电压门控钾通道,是目前所知的唯一位于细胞膜上的内质网-质膜接触点（ER-PM junction）链接蛋白。生理条件下,Kv2.1呈自由分散型和微米簇两种定位特征,前者通过电压依赖的K+电流调节细胞的基础电生理活动,后者与胞浆内质网上的蛋白形成稳定的膜接触位点并失去了电导功能。VAPA作为一种支架蛋白,通过自身的特殊位点与Kv2.1通道的非典型FFAT基序结合,共同构成ER-PM接触点的一部分。TMEM24/C2CD2L是新发现的位于ER-PM接触点的蛋白质,含有706个氨基酸,其主要功能是转运脂质,自身受Ca2+调控参与胰岛素的波动性分泌。Kv2.1、VAPs及TMEM24均存在于ER-PM接触点,三者在ER-PM接触点动态分布且均受磷酸化/去磷酸化的调节。因此猜测Kv2.1通道、TMEM24蛋白、VAPA蛋白之间可能存在互作并共同参与ER-PM接触位点的形成以及胰岛素分泌的调控。本研究意在阐明Kv2.1通道、VAPA蛋白以及TMEM24蛋白之间的相互作用及机制,对胰岛素的分泌以及二型糖尿病的预后和治疗提供新思路。研究目的:探究电压门控钾离子通道Kv2.1、囊泡相关膜蛋白VAPA和内分泌蛋白TMEM24之间的相互作用,并进一步研究其作用机理,为胰岛素的分泌机制提供新视角。研究方法:1.质粒构建:利用分子克隆的方法使用限制性核酸内切酶、DNA连接酶及其他修饰酶的作用,分别对目的基因和载体DNA进行切割修饰,将二者组合为新质粒;2.细胞转染:将Kv2.1通道、VAPA蛋白、TMEM24蛋白通过脂质体lipo2000转染进入细胞查看它们的表达情况;3.Western blot实验:检测Kv2.1通道、VAPA蛋白、TMEM24蛋白的表达水平;4.免疫共沉淀（Co IP）:在蛋白分子水平检测Kv2.1通道、VAPA蛋白、TMEM24蛋白的相互作用,进行定性分析;5.共聚焦显微镜拍摄及FRET现象检测:在生理条件下对活细胞内的两种蛋白质分子之间的距离进行检测,用于验证蛋白质之间的直接相互作用。研究结果:1.Kv2.1通道与TMEM24蛋白在ER-PM接触位点存在直接相互作用;2.TMEM24蛋白的CTR结构域是其与Kv2.1通道相互链接的主要结合位点;3.Kv2.1通道与VAPA蛋白、TMEM24与VAPA蛋白,均在ER-PM接触点存在相互作用;4.TMEM24蛋白抑制了Kv2.1和VAPA介导的ER-PM接触点的形成;5.TMEM24的CTR片段是其抑制Kv2.1/VAPA介导ER-PM接触点形成的关键结构,而Esyt1蛋白无上述影响;6.TG诱导细胞内共转的TMEM24、Kv2.1和VAPA蛋白在ER-PM接触点部位形成高度共定位的簇状结构。研究结论:位于质膜上的Kv2.1通道蛋白与内质网跨膜蛋白TMEM24具有直接相互作用,TMEM24的CTR结构域是重要的链接位点。Kv2.1通道与VAPA蛋白以及TMEM24蛋白与VAPA蛋白也存在相互作用,Kv2.1、VAPA、TMEM24三者之间可能存在竞争互作从而参与调控ER-PM的接触位点的形成,胞内钙离子可以影响这种竞争关系。
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