本课题将选择性COX-2抑制剂塞来昔布制成PLGA微球缓释剂型，观察其对大鼠角膜移植后新生血管的抑制作用。 第一部分:大鼠角膜移植后无干预下新生血管观察 目的:观察大鼠同种异体穿透性角膜移植后无干预下角膜新生血管生长演变规律。 材料和方法:健康清洁级雌性SD大鼠34只右眼行同种异体穿透性角膜移植，分别于术后4天、7天、15天和30天在显微镜下观察角膜新生血管生长情况，并通过公式I×C×0.02×3.142（m㎡）计算角膜移植后新生血管面积。C为新生血管占角膜钟点数；I为新生血管从角膜缘开始向角膜中心延伸的垂直长度。 结果: 1.角膜新生血管发生率 34只大鼠中5只在观察期间因麻醉意外和手术并发症剔除统计，剩余29只于术后第4天开始出现新生血管，至30天时全部出现，角膜移植后新生血管发生率达100%。 2.角膜新生血管形态 首先延伸至角膜缘的结膜血管迂曲增粗，充盈明显，单支或发散成多个簇状分支；角膜新生血管如细密的毛刷状自边缘向中心纵向生长，后其中部分血管逐渐增粗、扭曲，末端呈树枝状分支，由植床逐渐侵入植片。最终在高峰时期纵横交错成网状，遍满全角膜 3.角膜新生血管面积 角膜移植后第4天、7天、15天和30天角膜新生血管平均面积（X±S）分别为0.49±0.15m㎡，1.17±0.24m㎡，1.08±0.32和0.55±0.16m㎡，总平均面积0.84±0.67m㎡。 4.角膜新生血管面积变化 术后第7天血管面积达峰值，以后逐渐下降，15天时为峰值的90%，30天时降至峰值的1/2。 结论:移植的34只眼中5只剔除统计范围，剩余29只眼全部出现新生血管，移植后新生血管发生率达100%。新生血管最初环角膜缘呈毛刷状生长，后向角膜中央蔓延，为扭曲粗大的血管，末端呈树枝状分支。高峰时期交叉密布成网状，以后逐渐萎缩。角膜移植后第4天、7天、15天和30天角膜新生血管平均面积（X±S）分别为0.49±0.15m㎡，1.17±0.24m㎡，1.08±0.32和0.55±0.16m㎡，总平均面积0.84±0.12m㎡；术后第7天血管面积达峰值，以后逐渐下降，15天时为峰值的90%，30天时降至峰值的1/2。 第二部分:乳化-溶剂挥发法制备塞来昔布和空白PLGA微球 目的:使用乳化-溶剂挥发法制备塞来昔布和空白PLGA微球。 材料和方法:使用乳化-溶剂挥发法制备塞来昔布PLGA微球和空白PLGA微球。激光粒度分析仪测定微球的粒径；扫描电镜下观察微球的形态；HPLC检测塞来昔布微球的载药量和包封率；动态透析法检测塞来昔布微球体外释放；将塞来昔布微球制成混悬液注入大鼠角膜移植模型结膜下，HPLC检测给药后1天，5天，7天，15天和30天时角膜药物浓度以测定其体内释放情况。 结果: 1.微球的平均粒径为1.5μm，扫描电镜下观察到微球呈圆球形，表面光滑，分散状态良好。 2.微球平均载药量为6.3%，包封率为65%。 3.微球体外释放累积释药量如下：1天13.64μg（9.21%），2天17.185μg（11.6%），3天19.569μg（13.22%），4天23.532μg（15.9%），6天26.884μg（18.17%），8天27.72μg（18.72%），10天29.6μg（20%），15天30.175μg（20.39%），30天34.98μg共有23.63%塞来昔布从微球中释放出来。 4.1天，5天，7天，15天和30天时角膜中塞来昔布浓度分别175.46μg/g，276.45μg/g，317.06μg/g，570.75μg/g和448.71μg/g。 结论:微球的平均粒径为1.5μm，呈圆球形，表面光滑，分散状态良好。塞来昔布微球平均载药量6.3%，包封率为65%，体外释放测试30天时累积释药量34.983μg，占总载药量的23.63%。大鼠角膜移植模型体内释放测试中塞来昔布浓度在1天-15天时浓度逐渐升高，15天时达峰值570.75μg/g角膜组织，30天时降低至448.71μg/g角膜组织。塞来昔布PLGA微球能使角膜中药物浓度在设定时间内维持在有效浓度以上，达到质量要求。 第三部分:塞来昔PLGA微球治疗大鼠角膜移植后新生血管实验观察 目的:观察塞来昔布PLGA微球对大鼠角膜移植后新生血管的抑制作用。 材料和方法:健康清洁级雌性SD大鼠60只随机分为塞来昔布PLGA微球治疗组和空白PLGA微球对照组，每组各30只。所有大鼠右眼行同种异体穿透性角膜移植，术后立即结膜下注射0.02mlPLGA微球混悬液。于术后7天、15天和30天分三批观察取材，每次每组各取10只。裂隙灯显微镜观测角膜新生血管面积，角膜病理切片后分别行HE染色和免疫组化观察，并通过ELISA检测角膜中PGE2和COX-2含量。行非平衡析因设计的方差分析，P<0.05认为有显著性差异。 结果: 1.角膜新生血管发生率 大鼠同种异体穿透性角膜移植60只，因大鼠死亡及各种术后并发症等共13只剔除统计，剩余47只至观察终点全部出现不同程度的新生血管，角膜移植后新生血管发生率达100%。 2.角膜新生血管形态变化 空白组和治疗组角膜新生血管形态与生长演变与第一节移植后无干预下观察结果基本相同，首先延伸至角膜缘的结膜血管迂曲增粗，发出一簇或多簇分支，呈典型的圈套样血管环，新生血管环角膜缘呈竖立的细密毛刷状，后新生血管逐渐演化成延伸至角膜中心的长而扭曲的血管簇，最终纵横交错遍布全角膜，再萎缩成影子血管。治疗组相对空白组角膜新生血管出现时间晚且血管较纤细，数量也较少。 3.角膜新生血管面积 角膜移植后第7天、15天和30天空白组角膜新生血管平均面积（X±S）分别为1.17±0.69m㎡，1.08±0.86和0.55±0.46m㎡，总体平均面积0.93±0.71m㎡，治疗组分别为1.04±0.49m㎡，0.64±0.54 m㎡和0.24±0.23m㎡，总体平均面积为0.67±0.54m㎡。治疗组和空白组角膜新生血管面积无差异（F=2.831，P=0.10）；不同观察时间之间角膜新生血管面积有差异（F=5.682，P=0.007）；治疗组新生血管面积各观察时间点间差异有显著性（F=5.125，P=0.015），多重比较7天组和15天组及15天组和30天组间差异有显著性。组间和不同观察点间无交互效应（F=0.281，P=0.756）。 4.角膜病理切片HE染色及免疫组化 角膜全层结构完整，上皮层，基质层和后弹力层都清晰可辨。7天时空白组角膜基质中大量血管腔隙密布，分布均匀。治疗组基质新生血管集中在上皮侧，内皮侧血管相对空白组明显较少。术后15天两组基质新生血管较7天时减少，管腔缩小，部分闭锁退化。血管集中在基质近上皮侧血管。30天时角膜新生血管进一步退化，空白组管腔都已基本闭锁，仅靠近上皮侧基质中仍有深染的血管内皮细胞核；治疗组血管腔横断面更加稀疏，基质中红色均染的胶原样物质分解疏离成条状。 5.角膜PGE2含量 空白组角膜PGE2含量（X±S）在角膜移植后第7天、15天和30天分别为112.38±127.1pg/ml，40.45±39.27pg/ml和31.04±15.28pg/ml，总体平均量56.97±74.25pg/m；治疗组角膜PGE2含量（X±S）分别42.49±9.52pg/ml，41.11±15.84pg/ml和41.99±17.13pg/ml，总体平均为41.82±13.81pg/ml。 6.角膜VEGF含量 结论: 1.60只大鼠中移植后角膜新生血管发生率达100%。空白组和治疗组角膜新生血管形态与生长演变与第一节移植后无干预下观察结果基本相同，但治疗组相对空白组角膜新生血管出现时间晚且血管较纤细，数量也较少。治疗组新生血管面积在三个观察时间点均小于空白组，并逐渐递减。治疗组和空白组角膜新生血管面积无差异；治疗组新生血管面积各观察时间点间差异有显著性。 2.移植后角膜各层结构完整清晰，新生血管集中分布在角膜基质近上皮侧，基质胶原纤维束薄板较正常情况下疏松，大量血管充填，可见多个血管腔隙的纵切面，并有大量炎性细胞浸润。随着血管腔隙闭合，炎性细胞浸润减少，内皮侧基质恢复紧致结构。治疗组相对空白组血管数量少，管腔闭合较早且完全，炎性细胞少，基质中胶原纤维薄板更接近正常致密状态。7天时血管生长最旺盛，15天时血管开始消退而30天时数量进一步减少。 3.塞来昔布PLGA微球组和空白对照组角膜PGE2和VEGF含量有差别。各观察时间两组角膜PGE和VEGF含量有差别。7天时空白组角膜PGE2含量显著高于治疗组，15天以后两组角膜PGE2含量则较接近。7天至15天时治疗组和空白组角膜VEGF含量差别不大，30天时治疗组角膜VEGF含量显著降低。塞来昔布作为一种选择性COX-2抑制剂通过抑制COX-2减少角膜移植后角膜中PGE2的合成，最终导致VEGF含量减少。证实了选择性COX-2抑制剂以COX-2为作用靶点，调控血管内皮细胞上花生四烯酸瀑布的发动，抑制前列腺素类产物的合成，如PGE2，最终减少VEGF的合成。