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李坏死环斑病毒(prunus necrotic ring spot virus, PNRSV)是樱桃上的一种重要的病毒。由于其寄主范围广,危害严重,国际上已将此病毒作为脱毒研究的主要对象之一。PNRSV 可危害大多数核果类果树,特别是PNRSV 属我国二类检疫对象。本研究根据生产实际,对甜樱桃茎尖组培脱毒、离体叶片再生、超低温处理进行了研究, 利用RT-PCR技术对部分试管苗进行了PNRSV的检测。 以甜樱桃嫩梢芽为外植体进行茎尖组培脱毒研究,结果表明:筛选出增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L+AgNO35.0～10.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L,丛生芽增殖数达到6 个以上。确定良好的生根培养基为1/2MS+IBA 0.7mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L,生根率可达75.1%,移栽成活率可达80.5%以上。 利用甜樱桃的无菌苗叶片做外植体,进行离体叶片再生不定芽研究。结果表明:培养基中添加的激素浓度、种类和配比均影响不定芽再生,6-BA 和NAA 组合诱导甜樱桃离体叶片再生的活性较强; 在MS+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L+ GA30.5mg/L+AgNO35.0～10.0mg/L 培养基上,通过3 次继代培养的不定梢的叶片,再生不定芽的频率达6.4%。由此可见,选择适宜的激素浓度、种类和配比是诱导离体器官高效再生的先决条件。 用玻璃化法超低温保存甜樱桃,切取经5℃低温驯化30d 的离体茎尖置于固体培养基(MS+0.3、0.5、0.7 mol/L 蔗糖)预培养各1d 及藻酸钠包埋后,在无菌空气中干燥脱水4h 后,在PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)的保护液中处理60min 后浸入液氮,0℃冰水浴化冻2h,然后接种到标准培养基上,21d 后调查,茎尖存活率达28.7%。 采用特异引物的RT-PCR 扩增方法,对3 个甜樱桃品种进行了李坏死环斑病毒(PNRSV)的检测。结果表明,0.5～0.8mm 茎尖培养对李坏死环斑病毒(PNRSV)的脱毒率达78.5%;0.5mm 以下茎尖培养对PNRSV 的脱毒率达93.3%, 证明甜樱桃试管苗0.5mm 以下的小茎尖培养能有效脱除PNRSV病毒。 本研究揭示了培养基中添加的激素浓度、种类、配比对甜樱桃不定芽再生的影响特点,论证了超低温冷冻处理在樱桃组培脱毒上的应用前景。这一结果不仅加深了对超低温冷冻处理技术的认识,而且还为樱桃病毒病的茎尖脱毒提供了新的途径。同时探讨了离体叶片的再生条件,并筛选了基本培养基的种类,这些都有助于樱桃组培技术的进一步完善。