研究背景颅脑创伤(Traumatic Brain Injury, TBI)死、残率高,在全身创伤中高居第一位,其原因是大脑生命中枢神经组织严重受损,神经功能障碍所致,要解决神经功能重建就必须攻克神经再生这一重大基础性课题。成功的神经再生可分位以下三个阶段：(1)受损神经元及其支持细胞的存活；(2)由存活神经元再生的轴突生长跨过损伤区；(3)新建立的神经环路成功补偿神经系统损伤区的功能缺失。传统观念认为,神经再生仅存在于周围神经系统(peripheral nervous system)和处于发育期的中枢神经系统(central nervous system,CNS),而成熟后的中枢神经不可再生。然而Aguayo等在将外周神经组织移植到中枢神经损伤部位后发现,轴突延伸到移植物中。但当再生的轴突在移植物远侧界面遇到宿主组织细胞时候,就出现了生长抑制。这项研究推翻了传统的观念并形成新的概念：中枢神经轴突并非缺乏再生能力,而是中枢内环境不适合再生。目前形成的共识是内环境的不同主要是由于它们所拥有的神经胶质细胞的类型不同造成,周围神经系统的胶质细胞为雪旺细胞,而中枢神经系统则为少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞三种。最新的研究表明,CNS损伤后会启动一系列与形成瘢痕组织相关的细胞及分子间的反应,最终形成以星形胶质细胞为主的瘢痕组织,环绕着充满组织液的囊泡。胶质瘢痕对轴突再生的影响除了空间阻碍等物理因素外,由形成瘢痕的细胞所分泌的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在损伤区的堆积也是抑制轴突再生的重要因素。目前已知,硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulphate proteoglycans,CSPGs)和腱糖蛋白-R(Tenascin-R, TN-R)(?)即为瘢痕组织中所含有的最重要的两种有轴突生长抑制作用的成分,以上因素再加上损伤区神经营养因子的缺如、免疫反应、内分泌激素的刺激以及自由基的损害加速了CNS神经元的损伤,最终阻碍了CNS的再生有研究发现,使用软骨素酶ABC可以消化分解损伤区堆积的CSPGs,从而能促进损伤后的轴突再生,而单独针对TN-R的处理措施则未见有报道。但有人利用TN-R基因敲除鼠研究发现,脊髓损伤后,基因敲除鼠的运动能力恢复情况好于野生型鼠；也有人通过面神经损伤模型研究发现,TN-R基因敲除的小鼠在面神经损伤一定时间后,触须抖动的次数明显多于野生型小鼠。以上研究均说明,针对TN-R进行处理亦有可能促进中枢神经损伤后的轴突再生。但鼠TN-R基因敲除后出现了运动协调能力的减退,更容易被激怒,对环境的适应能力下降等副作用,说明要想将TN-R作为药物靶点来促进中枢神经损伤后再生必须使用针对其特定结构域的方法以避免上述不良反应,且最好是局部给药。TN-R蛋白是一个大的多域蛋白,其由富含半胱氨酸N末端序列,4.5个表皮生长因子样(EGFL)的重复序列,8个纤维连接蛋白Ⅲ样序列(FN)和C末端构成,与纤维蛋白素原钙连接序列具有同源性,基因序列分析其结构高度保守人和大鼠的同源性为93%。目前研究发现,TN-R分子上具有神经元胞体和生长锥排斥活性的主要为EGF及FN3-5结构域。因此,本研究使用原核方法构建了人TN-R蛋白的EGFL片段,并制备了兔来源的相应抗血清,于体外利用该抗血清与TN-R蛋白以不同组合包被多孔板形成不同的培养基质,研究其对于大鼠皮层神经元的影响。虽然单克隆抗体有更高的特异性,但其技术要求高,成本相对高昂。而本研究主要是初步观察中和靶片段能否对神经元产生影响,故先行使用经典的、容易获得的含高浓度多克隆抗体的抗血清。第一部分人TN-R蛋白EGFL片段(aal99-323)的原核表达及其抗血清的制备目的：制备高浓度兔来源的EGFL(aa199-323)片段抗血清并进行鉴定,为进一步研究其体外功能奠定基础。方法：将含TN-R蛋白氨基酸编码序列基因的质粒,设计引物PCR得到目的片段,在c端加上6×His的碱基,连接入PGEX-4T-1载体,构成融和蛋白,测序证实基因序列与预期一致。将PGEX-4T-1-TN-Raa199-323转化入Rosetta感受态细胞,挑取菌落PCR阳性的单菌落接种于卡那霉素抗性的LB培养基中,培养至OD为0.6-0.8时分别加入不同终浓度的IPTG诱导,在不同时间点分别收集样本行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色显示蛋白条带,分析确定最佳诱导表达条件,取最高蛋白表达量的菌液适量离心,沉淀重悬于裂菌缓冲液,冰浴超声裂解,分别取上清、沉淀行SDS-PAGE电泳及Western blot检测,以明确目的蛋白在宿主菌中的表达形式并验证融合蛋白是否正确表达。优化表达条件下,大量培养1000mL菌液,离心后收集菌体沉淀,裂解缓冲液重悬细菌,冰浴后超声破碎,离心获取包涵体,脲溶解后经Ni-NTA螫合树脂层洗脱回收目的蛋白。BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳结果经Bandscan5.0图像分析软件计算蛋白纯度。为了获得纯度更高的蛋白,将全部蛋白初样经SDS-PAGE电泳分离后,切取目的蛋白胶块-80℃冻存。冻存过夜的蛋白胶块加适量弗氏佐剂研磨,从分乳化后,新西兰大白兔背部多点皮下注射。每隔7天进行一次加强免疫,第三次免疫注射后的第10天经静脉少量采血,离心获得血清,以免疫前兔血清作为阴性对照,ELISA测定血清效价,确定效价达到预期水平后即经颈内动脉放血,照静脉取血后的方法收获抗血清,分装成10μl后-80℃冻存。表达PGEX-4T-1-TN-Raa199-323融合蛋白的Rosetta菌体总蛋白及提取的大鼠脑组织膜蛋白进行SDS-PAGE电泳,制备的TN-R蛋白EGFL抗血清为一抗,Western blot法验证抗体的特异性。用纯化后PGEX-4T-1-TN-R aa199-323融合蛋白包被ELISA反应孔,以免疫前兔血清作为阴性对照,ELISA法检测该抗血清的效价。结果：重组质粒转化后PCR阳性菌株经IPTG诱导,收集细菌蛋白。SDS-PAGE电泳显示,在37℃、1mM IPTG诱导4h的条件下,融合蛋白高表达,经抗His标签的单克隆抗体行Western blot鉴定证实该蛋白条带为PGEX-4T-1-TN-Rａａ199-323融合蛋白；菌体沉淀经超声破碎后,上清及沉淀的SDS-PAGE电泳结果进一步证明,该重组蛋白主要以包涵体形式存在。再按该优化表达条件扩大培养体系,收获包涵体蛋白,纯化后回收重组融合蛋白。BCA法测定蛋白浓度为0.65mg／L。将获得的蛋白免疫成年健康新西兰大白兔后,家兔健康状况良好,未出现死亡及其他异常反应。第3次免疫注射后的10d经耳缘静脉取血,ELISA测定血清效价均高于1:512000,达到预期效价,即改用颈动脉采血法收获血液共32ml,制备抗血清10ml,收获的对照血清及抗血清均经过0.18μm滤膜滤过除菌,分装后于-80℃冻存。结论：人TN-R蛋白EGFL片段可经原核表达,所获得的蛋白片段免疫新西兰大白兔后可制备高效价及较高特异性的抗血清。为进一步研究其体外功能奠定了基础。第二部分SD大鼠皮层神经元的原代培养及鉴定目的：改进现有的皮层神经元原代培养技术,获得稳定的、操作简便、生长状态好的培养方法,并对该方法培养的神经元进行鉴定。方法：使用单细胞悬液法及小组织块法分别培养,两种培养方法分别如下所述：单细胞悬液法为在无菌条件下取出出后2-3d的SD大鼠大脑,于显微镜下去除脑膜、血管后使用弯显微剪刀剪取皮层灰质,将皮层粗剪成3-5mm3或更小碎块,用0.05%胰酶及10ug/ml DNAse I37℃下消化8～10min,用胎牛血清终止消化,通过200目筛网后1000转／分离心5分钟弃上清,使用DMEM/F12培养基洗涤两次,使用含10%FBS的DMEM/F12重悬,以1～3×105/cm2密度(按实验目的不同而使用不同的细胞密度)接种于预先包被好培养基质的多孔板中,再加入青霉素和链霉素,4-6小时后全部更换为含2%B27的Neurobasal-A无血清培养基中,并加入L-谷氨酸,以后每3-5天半量换液一次。小组织块法则在将皮层剪成3-5mm3碎块后,用无菌注射器管芯挤压滤过50目不锈钢滤网,收集滤液,800转／分离心3分钟,弃上清,使用DMEM/F12培养基漂洗下层组织块,再使用20ul微量加样枪吸取300-500um直径的小组织块于显微镜下接种入预先准备好培养基质的多孔板中,30～60分钟待组织块贴壁后每孔加入200ul含2%B27的Neurobasal-A无血清培养基,20小时后再每孔轻柔的加入300ul该培养基,并加入L-谷氨酸,以后每3-5天半量换液一次。两种培养方法培养第7天后,倒置相差显微镜下观察细胞,选取生长状况良好的细胞使用4%多聚甲醛固定,β-Ⅲ-tubulin抗使用间接法免疫荧光染色,荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察并拍照。结果：单细胞悬液法培养大鼠皮层神经元,每只新生大鼠可获得2～16×106个细胞,荧光显微镜下显示多数细胞为染色阳性细胞,激光共聚焦显微镜下可见染色阳性细胞突起生长状况良好,相互之间连接紧密,呈现典型的网格状；小组织块法大部分组织块可以贴壁并从中迁徙出细胞,倒置相差显微镜下观察细胞透明,呈向心性生长,细胞周边光晕明显,有较多突起生长,并形成稀疏网络。结论：使用改进的大鼠皮层神经元原代培养方法可获得大量的较高纯度神经元,神经元贴壁良好,突起生长良好,小组织块法组织块大部贴壁并迁徙出细胞,均可应用于下阶段研究。第三部分人Tenascin-R蛋白EGFL片段抗血清对大鼠皮层神经元的影响目的：研究人Tenascin-R (TN-R)蛋白的EGFL功能片段及该片段抗血清,联合Tenascin-R蛋白研究其在体外对大鼠皮层神经元的作用影响,探讨该功能片段抗血清用于治疗中枢神经损伤后再生的可行性。方法：将实验第一部分制备的多克隆抗血清联合TN-R蛋白包被多孔板形成不同的铺板状态,据不同的铺板状态进行分组,再照实验第二部分的细胞培养方法按不同的分组接种入多孔板中,培养一定时候后于倒置相差显微镜及荧光显微镜下观察在不同条件下不同铺板状态对于大鼠皮层神经元黏附、迁徙及突起生长的影响获得的数据使用数据以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件进行处理,实验结果组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果：实验第一部分制备的抗血清在体外条件下单独存在时对神经元无作用影响,但能增加TN-R蛋白对于大鼠皮层神经元的黏附,部分中和其对于突起生长的抑制作用,使从皮层组织块中迁徙出的细胞及其突起进入包被有TN-R蛋白的区域生长。结论：TN-R蛋白的EGFL片段抗血清在体外能削弱TN-R对于神经元生长的抑制功能,有望将该抗血清用于体内,为中枢神经系统系统损伤后轴突再生创造有利的内环境。