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昆虫的嗅觉系统在适应环境方面起着不可替代的作用,对它们的行为有着重要的影响。长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)危害各种丛生竹类,是一种重要的钻蛀性林业害虫,主要分布于我国南方,对竹类产业发展影响极大。性信息素结合蛋白作为控制成虫觅偶行为的关键物质,其结合机制也成为当前研究热点。本文对长足大竹象性信息素结合蛋白Cbuq PBP1的结合机制进行研究,探索Cbuq PBP1的关键结合位点,为研究长足大竹象性信息素结合蛋白作用机制提供新的方法和途径,为后续研究打下基础。通过同源建模预测Cbuq PBP1的三维结构,将建模得到的Cbuq PBP1与气味物质进行分子对接,预测蛋白与气味物质结合的关键位点,通过定点突变技术突变关键位点,并用大肠杆菌原核表达原蛋白Cbuq PBP1与突变蛋白,通过荧光竞争结合试验比较突变前后结合特性。主要研究结果如下:1、根据同源蛋白的氨基酸序列进行同源建模,结果表明Cbuq PBP1具有昆虫性信息素结合蛋白的基本结构特征,具有6个α螺旋,3个二硫键,由6个保守的半胱氨酸残基Cys36-Cys67、Cys63-Cys121、Cys110-Cys130被氧化形成,起着稳定蛋白空间结构的作用,Cbuq PBP1内部结合口袋由反向平行α1、α3、α4、α5、α6形成,α2则位于口袋上方,形成如盖子一样的结构盖住蛋白的结合口袋,使其结构更加稳定。位于蛋白活性区域内有10个疏水性氨基酸残基,参与疏水性气味分子的结合,与疏水性气味分子的运输作用相关。2、前期试验结果表明邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯和邻苯二甲酸二丁酯与Cbuq PBP1有较好亲和性,所以在已经构建好的Cbuq PBP1的三维结构的基础上,将蛋白与这两种气味物质进行分子对接,并根据对接结果中结合能强弱以及距离长短,对蛋白结合性信息素的关键结合位点进行预测。分析Cbuq PBP1与气味化合物的对接结果发现,Cbuq PBP1与气味分子邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯在Phe-69、His-53分别形成CH-π和氢键相互作用,所以推测Phe-69、His-53为Cbuq PBP1的关键结合位点。3、利用搭桥法(重叠延伸PCR)定点突变技术,对已经预测的Cbuq PBP1的两个可能结合性信息素的关键结合位点成功进行了氨基酸替代,将组氨酸(His-53)、苯丙氨酸(Phe-69)均成功突变为丙氨酸(Ala),然后将两个突变体及未突变基因的表达载体转入大肠杆菌,经IPTG(1mM)诱导,37℃震荡培养3 h后,均能在上清液中成功表达,并纯化出纯度为85%的蛋白,为后续试验提供实验材料。4、以1-NPN为荧光探针,研究了Cbuq PBP1及两种突变蛋白与邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸二丁酯、柏木醇、苯并噻唑的竞争结合能力。其中,Phe-69对于Cbuq PBP1结合性信息素有影响,但只有柏木醇和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯终浓度大于50 mM时,荧光峰值未下降到一半,可能只对Cbuq PBP1结合口袋构象产生影响,并不是其关键结合位点;而将His-53突变后,当气味物质终浓度大于50 mM时,荧光峰值未下降到一半,说明Cbuq PBP1结合能力几乎丧失,表明His-53是Cbuq PBP1的关键结合位点,对Cbuq PBP1的功能是至关重要的。综上,表明长足大竹象性信息素结合蛋白Cbuq PBP1的His-53,是蛋白与气味物质的关键结合位点,Phe-69是蛋白与气味物质的结合位点;氢键为Cbuq PBP1与气味物质结合的主要作用力。